尖孢镰刀菌古巴专化型中SIX2和SIX6基因敲除突变体的生物学特性

尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense,Foc)依据对寄主易感性分为4个不同的生理小种,其中4号生理小种(Foc4)几乎能危害目前所有栽培品种。为研究其SIX(secreted in xylem)蛋白编码基因SIX2和SIX6在Foc4对寄主差异性选择中的作用,利用PEG介导的原生质体转化法将基于pCT74质粒框架构建的SIX2、SIX6基因敲除质粒分别转入Foc4 B2菌株,分别得到了SIX2和SIX6基因敲除突变体,然后分析敲除突变体与野生型的生物学特性差异。生物学研究结果表明:SIX2、SIX6基因的缺失突变体均呈现菌丝稀疏、生长速率减慢、产孢率降低、菌丝异核率增加,对渗透压、外源氧等外源胁迫更为敏感等特征。致病力分析实验发现ΔFoSIX2和ΔFoSIX6突变体的孢子在香蕉苗的幼嫩根部附着量减少,孢子根部定殖能力降低;ΔFoSIX2菌株基本上丧失了对巴西蕉的致病力,而对粉蕉仍有较强的致病能力;ΔFoSIX6菌株则对粉蕉苗、巴西香蕉苗盆栽致病力均呈极显著下降。依据生物学与致病力测定结果,推测Foc4中SIX6基因决定Foc4对寄主的致病力,而SIX2基因则决定Foc4对寄主的差异性选择能力。

Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体及其稳定细胞株的构建

目的筛选并包装Six2基因shRNA敲减的慢病毒,建立稳定表达敲减Six2基因的黑质多巴胺能神经元MES23.5细胞系。方法合成三种(分别命名为p LV-sh Six2-1、p LV-sh Six2-2、p LV-sh Six2-3)含敲减Six2基因干扰序列的双链DNA oligo,并将其连接于含有嘌呤霉素抗性的p LV-H1-EF1a载体质粒,均采用慢病毒包装四质粒系统(pRRE/p VSVG/pREV/p LV)包装并转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系(293T细胞)以获取慢病毒p LVsh Six2。收集敲减Six2基因的p LV-sh Six2-1、p LV-sh Six2-2、p LV-sh Six2-3慢病毒质粒及对照质粒上清,感染黑质多巴胺能神经元细胞(MES23.5细胞),分别设为p LV-sh Six2-1组、p LV-sh Six2-2组、p LV-sh Six2-3组及对照组,Western blot法检测各组细胞Six2蛋白表达,鉴定各组Six2干扰序列的敲减效果。嘌呤霉素法筛选稳定敲减Six2的MES23.5细胞株。结果酶切结果表明在262 bp及约9 000 bp处分别有明显条带,测序结果显示所测序列与敲减的Six2干扰序列完全一致。Western blot结果显示干扰序列sh Six2-2对应的细胞中Six2蛋白表达显著降低,sh Six2-1和sh Six2-3蛋白表达降低效果不明显。用嘌呤霉素筛选病毒感染的p LV-sh Six2-2组细胞系成功。结论成功构建并筛选了Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体,建立了稳定敲减Six2基因的MES23.5细胞株。

SIX2基因在肾母细胞瘤患儿血液中的表达及其甲基化

目的探讨肾母细胞瘤患儿血液中SIX2基因的转录表达及其启动子甲基化状态以及其与临床病理学特征的关系。方法收集自2008年10月至2012年1月入住郑州大学第一附属医院小儿外科的45例肾母细胞瘤患儿作为病例组（男29例、女16例），以健康体检或就诊的性别、年龄匹配的排除肿瘤等恶性疾病患儿15例作为对照组。采集所有研究对象外周血，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和甲基化特异性PCR（MSP）法检测SIX2基因转录表达水平及其启动子甲基化状态，t或X2检验比较组间差异，并分析病例组中两者与临床病理特征的关系及SIX2基因的甲基化对其转录表达的影响。结果病例组中SIX2mRNA的相对表达量（RQ）高于对照组（1．93±1．10比0．57±0．39，t=5．354，P=0．000）；病例组SIX2基因甲基化阳性者有8例，对照组12例，病例组中甲基化阳性比率更低（x2=19．600，P=0．000）。病例组的RQ值与肿瘤大小、临床分期、病理分型、淋巴转移、治疗转归均有关（均P〈0．05）。病例组和对照组中甲基化组的RQ值均低于非甲基化组（1．35±0．44比1．95±1．15，0．43±0．29比1．13±0．20，t=2．459、3．896，P=0．020、0．002）；甲基化组中病例组的RQ值高于对照组（t=5．624，P=0．000）；非甲基化组中两者之间的RQ值比较差异无统计学意义（t=1．222，P=0．229）。结论肾母细胞瘤外周血中SIX2基因的异常甲基化与转录表达有关，是基因表达调节方式之一，并与肾母细胞瘤的发生发展有关；SIX2基因在发生甲基化的肾母细胞瘤中有可能充当癌基因的角色，转录水平的过表达与其甲基化状态有负相关倾向。

肾母细胞瘤患儿SIX2基因的转录表达及其启动子甲基化状态的意义分析

目的探究小儿肾母细胞瘤（WT）组织和血液中SIX2基因在mRNA水平的相对表达量及启动子是否发生甲基化,并观察其与患儿的基本临床资料之间的关系,以期为临床靶向基因治疗提供科学的依据。方法选择2011年3月至2015年7月就诊并确诊的64例WT患儿[男30例,女34例;年龄3~67（26.9±8.6）月]为研究对象,运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）分别检测患儿WT组织、瘤旁组织和外周血以及18例健康儿童外周血中SIX2基因在mRNA水平的相对表达量及启动子甲基化状态。结果 WT患儿瘤组织SIX2 mRNA的相对表达量明显高于瘤旁正常组织（P〈0.01）,SIX2 mRNA启动子的甲基化阳性率明显低于瘤旁正常组织（P〈0.01）;WT患儿外周血中SIX2 mRNA的表达量明显高于对照组外周血（P〈0.01）,SIX2基因启动子的甲基化阳性率明显低于对照组外周血（P〈0.01）。WT患儿组织SIX2基因相对表达量与患儿肿瘤大小、临床分期、病理类型、淋巴转移、血管浸润有关（P〈0.05,P〈0.01）,而与性别、年龄和复发无明显关系（P均〉0.05）。SIX2基因启动子的甲基化与上述临床资料均无明显关系（P均〉0.05）。随访36个月,死亡42例,存活22例,3年存活率34.4%;SIX2 mRNA相对表达量〉2.8和≤2.8的患儿存活率（23.8%vs 54.5%,P〈0.05）和存活时间[（13.3±5.2）月vs（22.2±8.7）月,P〈0.01]比较,差异均有统计学意义。SIX2启动子甲基化表达阴性和阳性的患儿3年存活率（14.3%vs 44.2%,P〈0.05）和存活时间[（14.5±4.5）月vs（22.1±4.9）月,P〈0.01]比较,差异均有统计学意义。结论 SIX2基因的高表达和其启动子的未甲基化可能是WT的发病基础,SIX2基因或可作为WT基因治疗的靶目标。