SK2和JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建SK2和JPH2双基因重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2,并检测其在转染后HEK293细胞中的表达。方法:以p CMV6-entry/SK2为模板,PCR扩增出SK2片段,通过BgⅢ/HindⅢ酶切位点克隆入真核表达载体p IRES-EGFP,将JPH2序列插入构建的SK2表达载体p IRES-EGFP-SK2,并通过酶切及测序鉴定。脂质体转染法将重组质粒p IRES-EGFP/SK2+JPH2转染HEK293细胞,采用Western blot法检测SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表达。结果:构建的重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2经酶切和测序鉴定,证实插入的序列与Gen Bank中的SK2和JPH2基因序列完全相同。p IRES-EGFP/SK2+JPH2质粒转染HEK293细胞48 h后,SK2和JPH2蛋白均能成功表达。结论:成功构建了重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2。

人心房肌KChlP2和SK2基因表达检测及方法研究

目的检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法提取人心房肌组织总RNA,采用RT-PCR方法获取KChIP2、SK2、GAPDH、β-actin目的片段,与pMD-18Tvector连接成重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α中,通过PCR和测序鉴定。提取含目的基因的质粒作为标准品。采用Taqman探针法与SYBR Green I法分别检测人心房肌SK2与KChIP2基因表达和构建标准曲线。结果人心房肌存在KChIP2和SK2基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与Pubmed数据库完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2>0.99。结论成功检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,构建的质粒标准品能用于后续实验。

小鼠SK2基因亚克隆的构建和鉴定(英文)

背景:小电导Ca2+激活钾(small conductance Ca2+-activated potassium channels,SK channels)通道存在于大多数可兴奋性细胞并在动作电位的复极化中发挥着重要作用。但SK通道与Ca2+及其他分子的偶合及调控途径尚未明确。目的:为观察SK2通道基因区段与Ca2+及其他分子的偶合及调控,构建pGBAT7和SK2基因片段重组子。方法:根据SK2基因的全长序列,设计3个SK2基因片段引物,经PCR扩增,测序鉴别后,分别亚克隆到酵母表达质粒pGBKT7。构建的pGBKT7-SK2亚克隆通过电转染法分别转染到酵母AH109菌中并被激活。pGBKT7-SK2亚克隆从酵母AH109菌中提取,电泳和测序鉴定。结果与结论:SK2目的基因PCR扩增产物分别为411,546,729bp。成功构建了3个含有411,546,729bp的pGBKT7-SK2亚克隆,电泳和测序鉴别表明构建的pGBKT7-SK2亚克隆完全符合设计要求。转染到酵母AH109菌中pGBKT7-SK2亚克隆可被激活,为探讨SK2通道与其他分子的功能相关提供了重要的物质基础。

人心房组织膜蛋白SK2的提取方法(英文)

目的:优化人心房组织膜蛋白提取方法。方法:分步离心法提取心肌膜蛋白,SK2膜蛋白用western-blot检测。结果:BCA检测出蛋白浓度,western-blot检测出蛋白条带。结论:此方法能够提取人心房组织的膜蛋白SK2,该方法简单,稳定,可靠,提取的膜蛋白质量好,浓度高,并能进行下一步的western-blot的实验,以便将来检测SK2膜蛋白在窦性和房颤患者心房组织之间表达的差异。

小电导钙激活钾通道SK2在容量超负荷心力衰竭大鼠窦房结表达的改变

目的观察小电导钙激活钾通道SK2通道在心力衰竭(HF)大鼠窦房结组织中表达的改变。方法以腹主动脉-下腔静脉穿刺造瘘术建立容量超负荷心力衰竭大鼠模型(n=7),假手术对照组(SO)大鼠切开腹腔,穿刺腹主动脉,但不造成腹主动脉-下腔静脉之间的瘘(n=7)。于术后8周通过超声心动图测定左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)、左心室收缩末内径(left ventricular end-systolic diameter,LVEDs)、左心室舒张末内径(left ventrieular end-diastolic diameter,LVEDd),并于取材时测定心脏质量/体质量(heart weight/body weight),评价心脏结构与功能改变。分离大鼠窦房结细胞以免疫荧光染色法观察SK2通道蛋白的表达,同时取材窦房结组织,提取组织蛋白,行Western blot测定比较心衰大鼠窦房结组织SK2通道表达的改变情况。结果超声心动图结果显示,心力衰竭大鼠心脏收缩功能与舒张功能明显减低[LVEDd(mm):SO 5.91±0.36 vs HF 11.15±0.91,P<0.01;LVEDs(mm):SO 2.89±0.28 vs HF 7.89±0.70,P<0.01;LVEF(%):SO 87.10±1.63 vs HF 62.10±2.57,P<0.01;LVFS(%):SO51.27±2.03 vs HF 30.05±1.66,P<0.01],心脏质量/体质量明显增大(SO 244.19±36.87 vs HF 593.21±28.72,P<0.01)。单细胞免疫荧光染色结果示SK2通道表达于两组大鼠窦房结细胞膜上,Western blot定量分析结果示心力衰竭组大鼠窦房结组织SK2通道蛋白表达水平较假手术组明显减低(0.22±0.10 vs 0.31±0.16,P<0.05)。结论 SK2通道在心力衰竭大鼠窦房结组织中表达明显下调。

大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位

目的:研究大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位,探讨二者的相互作用。方法:采用Western blot检测SK2通道及JP2蛋白在H9c2细胞中的表达,免疫共沉淀鉴定JP2与SK2通道之间的相互作用,免疫荧光标记观察SK2通道和JP2蛋白在H9c2细胞的定位。结果:心肌细胞H9c2表达SK2通道及JP2蛋白,SK2通道和JP2蛋白可形成免疫复合物,SK2通道和JP2蛋白存在部分共定位。结论:心肌细胞H9c2中SK2通道与JP2蛋白存在相互作用。

用2SK2554制作的低胆负载大功率放大器

本文介绍一款用大电流型MOS-FET2SK2554作输出管的直流功率放大器.该类大电流型场效应管原来是用于工业用机器人电机控制的开关器件.在移作半导体直流功率放大器的输出管时,具有漏极电流大、线性好的突出优点.但电极间的电容量较大,耐压低,制作大功率放大器有一定的难度.2SK2554是一种容易购买性能更为理想的大电流型MOS-FET,用它制作的低阻负载直流功率放大器,在2 Ω扬声器上可以获得165W的音频功率输出.

重叠PCR法构建人心房肌SK2(KCNN2)基因表达质粒及鉴定和序列分析

目的:小电导钙激活钾通道亚型2(SK2)在心房肌功能活动中起重要作用,但是由于其表达密度低,直接进行RT-PCR一步法无法得到该基因(KCNN2)的编码区全长序列,本研究旨在采用Overlapping PCR(重叠PCR)法进行基因全长序列的扩增和表达质粒的构建,探讨其在长片段基因扩增的应用。方法:收集人心房肌标本,采用提取总RNA之后逆转录为cDNA,分三段设计KCNN2基因(AY258141)引物进行分段扩增,同时进行分段测序,然后采用Overlapping PCR得到KCNN2基因编码区全长序列,通过限制性酶切位点定向克隆到表达载体pIRES-hrGFP上。采用酶切法和测序法进行鉴定。结果:三段KCNN2基因扩增产物大小与预测值一致,最后得到的表达质粒测序结果与基因库数据基本一致。结论:成功构建人心房肌SK通道基因表达质粒pIRES-hrGFP-SK2,Overlapping PCR能够很好的用于长片段基因扩增。

二性霉素B与β-escin混合穿孔电极液在人心房肌细胞SK2电流记录中的应用

目的:为研究钙离子对人心房肌细胞小电导钙激活钾通道电流(ISK2)的调节作用,建立用二性霉素B(amphotericin B)与β-escin穿孔的膜片钳(PPR)技术。方法:体外循环术中取得右心耳,应用急性酶分离获得单个人体心房肌细胞,用二性霉素B和/或β-escin作为穿孔电极液,进行穿孔膜片钳实验,在此模式下测试钙离子对人心房肌细胞SK2电流的调控作用,并用胞内钙测试系统验证穿孔前后胞内钙变化。结果:混合使用穿孔电极液6.88μg/mlβ-escin和150μg/ml二性霉素B与单独用150μg/ml二性霉素B或6.88μg/mlβ-escin相比,前一种方法细胞容易封接,能形成稳定的穿孔膜片钳记录模式,可观察到SK2电流有激活,且胞内钙测试系统检测时可观察到穿孔后电极液至细胞内的游离钙离子浓度的增加,F340/380增强。结论:适当浓度的二性霉素B与β-escin混合使用进行穿孔膜片钳实验是一种稳定的全细胞膜片的记录技术,可以用于胞内游离钙离子对SK2电流调控的研究。

高血压大鼠心肌2型小电导-Ca2+-激活-K+通道蛋白（SK2）表达的变化

目的:观察高血压大鼠心肌细胞2型小电导-Ca^2+-激活-K^+(SK2)通道蛋白表达情况。方法:12只健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组(5只)和实验组(7只),实验组采用N’-硝基-L-精氨酸(L-NNA 15 mg/(kg·d))腹腔注射制备高血压模型,对照组以等体积生理盐水腹腔注射,每天称量大鼠体重,每周测量血压及心电图变化,4周后处死大鼠取心脏;采用Western blot的方法检测心肌SK2通道蛋白表达水平。结果:给药4周后,与对照组相比,实验组大鼠血压明显升高(P<0.05),心电图QRS时长和R-R间期延长,实验组大鼠心房组织和心室组织SK2通道的表达均明显升高(1.12±0.18 vs 0.52±0.99,1.64±0.26 vs 0.99±0.22,P<0.05)。结论:高血压模型大鼠心房和心室SK2通道表达增加,其可能是导致高血压模型大鼠出现心律失常的机制之一,为高血压疾病的治疗和预后提供新的思路和策略。

西门子发布Sirius 3SK2用户友好型安全继电器

西门子最新推出的Sirius 3SK2安全继电器占用空间极小,能够实现诸多安全功能。该产品拥有用户友好型的拖放式参数配置界面,因而可以轻松自如地创建各种安全功能,并可进行扩展以将测试和故障诊断功能包含在内。Sirius 3SK2安全继电器有两款型号,一款宽22.5mm,最多可支持四种安全功能,与目前市面上其他可通过软件配置参数的安全继电器相比更纤巧;另一款宽45mm,最多可实现六种安全功能,该型号配备有故障诊断显示屏。3SK2故障安全输出端的功能可以独立分配。

Synaptobrevin-2促进心房肌SK2通道转运的机制研究

小电导钙激活钾通道亚型2(SK2通道)主要在心房表达,与心房颤动有关.高频刺激模拟心房快速起搏可以增加SK2电流,但是其中的机制并不完全清楚.本研究旨在研究转运调节蛋白Synaptobrevin-2(VAMP2)在调节心房肌细胞膜SK2通道转运过程中的作用.以培养的新生大鼠(Rattus norvegicus)心房肌细胞(NRAMs)和表达有SK2通道的HEK293细胞为研究对象,采用蛋白质印迹、膜片钳、共聚焦显微成像、流式细胞术和全内荧光反射等技术研究VAMP2对SK2通道转运的影响.结果发现,快速起搏可上调VAMP2蛋白和增加SK2通道蛋白在细胞膜上的表达,而敲低VAMP2可降低NRAMs细胞膜上SK2通道蛋白的表达.在HEK293细胞上共表达VAMP2和SK2,增加了SK2的表达,加速了SK2向细胞膜的转运,并通过抑制SK2内吞来稳定SK2通道蛋白在细胞膜上表达.由以上结果可知,VAMP2可能通过促进SK2通道的表达,转运和稳定细胞膜上的表达,参与快速起搏心房肌细胞SK2功能的增强.

西门子发布Sirius 3SK2用户友好型安全继电器

西门子最新推出的Sirius 3SK2安全继电器占用空间极小,能够实现诸多安全功能。该产品拥有用户友好型的拖放式参数配置界面,因而可以轻松自如地创建各种安全功能,并可进行扩展以将测试和故障诊断功能包含在内。Sirius3SK2安全继电器有两款型号,一款宽22.5mm,最多可支持四种安全功能,与目前市面上其他可通过软件配置参数的安全继电器相比更纤巧；另一款宽45mm，最多可实现六种安全功能，该型号配备有故障诊断显示屏。3SK2故障安全输出端的功能可以独立分配。

慢性心衰大鼠心肌2型小电导-Ca^(2+)-激活K^+通道及Junctophilin 2表达的改变

目的:检测慢性心力衰竭模型大鼠心肌细胞膜2型小电导-Ca^(2+)-激活K^+(SK2)通道和Junctophilin 2(JP2)蛋白表达的变化,为人类心力衰竭机制的研究和针对性的治疗提供新思路。方法:10只健康成年SD大鼠随机分为假手术组(5只)和手术组(5只),手术组采用腹主动脉缩窄的方法制备慢性心衰模型,假手术组大鼠分离腹主动脉后不进行缩窄术。每周观察各组大鼠心电图的变化,称量大鼠的体重,之后杀死大鼠取心脏和肺称重,计算心脏重量指数和肺系数;提取心脏组织蛋白,用Western blot的方法检测心肌SK2通道和JP2蛋白的表达水平。结果:术后第8周,手术组大鼠心电图ST段抬高或T波高耸;并且与假手术组相比,手术组大鼠心脏重量指数和肺系数均显著增加;心肌组织SK2通道的表达显著增加,JP2表达下降(P均<0.05)。结论:慢性心衰模型大鼠心肌JP2蛋白表达减小,SK2通道表达增加。

武汉地区第四纪磁性地层

武汉地区90%为第四系所覆盖,但目前针对第四纪年代地层的研究严重滞后。文中在武汉市城市地质调查施工的数百个钻孔中选择了地层发育齐全、适于进行磁性地层研究的SK2钻孔进行了古地磁极性测试和分析,并重点对SK2钻孔进行了磁性地层的划分,初步建立了武汉市第四纪磁性地层的年代序列。结果表明,SK2钻孔的布容与松山(B/M)界线位于孔深约29. 6m处,其古地磁年龄约0. 78Ma;松山反向带中的正极性亚时贾拉米洛(Jaramillo)、奥杜威(Olduvai)、留尼汪(Reunion)Ⅱ分别位于孔深38. 2～39. 8m、66. 5～71. 9m和75. 8～78. 4m处。依据磁性地层结果对研究钻孔进行了第四纪地层划分,SK2钻孔的1. 2～14. 1m为上更新统,15～29. 6m为中更新统,29. 6～78. 8m为下更新统。计算SK2钻孔地层的沉积速率后发现,古地磁年代1. 47～1. 57Ma BP和1. 07～1. 21Ma BP为2个沉积速率相对增大的阶段。

人心房组织小电导钙激活钾通道的分子鉴定(英文)

目的:证实人心房组织有SK2的存在。方法:RT-PCR和western-blot分别检测SK2的mRNA和蛋白。结果:RT-PCR检测到人心房组织中存在SK2的mRNA,western-blot检测到SK2的特异性条带。结论:人心房组织存在SK2。

松辽盆地白垩系大陆科学钻探松科2井:井底温度、地层压力预测

松辽盆地白垩系大陆科学钻探松科2井设计井深达6 400m,是东亚地区最深的科学探井。松辽盆地地温梯度高,深层孔隙流体压力组成与分布十分复杂,因此准确预测地层温度和压力,对整个钻探工程至关重要。通过对松科2井井区探井测温、试油数据的整理分析,探索目的层地温、地温梯度、地层压力与深度规律,对井底温度进行预测,并对主要目的层地层压力和地层破裂压力进行分段预测。利用深度与地温关系、深度与地温梯度关系和深井对比等方法,综合预测6 400m井底温度为238.83~265.11℃。利用松科2井井区地层压力与深度关系,破裂压力系数平均值和DrillWorks软件计算结果,综合预测营城组、沙河子组、火石岭组-井底地层压力分别为30.54~37.72、33.22~59.52和59.52~67.18 MPa,地层破裂压力分别为52.35~58.62,61.88~105.68和104.57~118.03 MPa。

松辽盆地松科2井下白垩统营城组火山-沉积序列精细刻画

中国白垩纪大陆科学钻探松科2井连续获取营城组岩心365.32m,岩心直径为214mm,岩心收获率达98.47%,是迄今直径最大,收获率最高且保存最为完整的营城组岩心,这些宝贵资料为营城组研究提供了前所未有的机遇。营城组时期与Aptian-Albian对应。通过对松科2井营城组岩心的精细描述,揭示了营城组火山-沉积序列及其建造过程。营城组主要包括沉积岩与火山岩两大岩类,共计17种岩石类型,其中沉积岩9种(砾岩、粗砂岩、中砂岩、细砂岩、粉砂岩、粉砂质泥岩、泥岩,含角砾凝灰质砂岩、凝灰质砂岩)、火山岩类8种(流纹岩、流纹质角砾集块岩、流纹质角砾集块熔岩、流纹质熔结凝灰熔岩、流纹质含角砾熔结凝灰熔岩、隐爆角砾岩、安山质集块熔岩与凝灰岩)。沉积相为扇三角洲相,具体分为扇三角洲平原亚相、扇三角洲前缘亚相与前扇三角洲亚相,分流河道微相、扇间沼泽微相,水下分流河道微相、河口砂坝微相与静水泥质沉积微相。火山岩相包括爆发相和喷溢相,具体分为空落亚相、热碎屑流亚相、喷溢相中部亚相和上部亚相。沉积岩与火山岩交替出现于营城组中,主要发育3期沉积岩与3期火山岩,自下而上形成3个完整的沉积-火山旋回,即沉积岩Ⅰ-火山岩Ⅰ、沉积岩Ⅱ-火山岩Ⅱ和沉积岩Ⅲ-火山岩Ⅲ。这一发现对于重新认识营城组时期构造-火山-盆地充填规律,可能具有重要启示。文中精细的描述资料为今后相关的深入研究提供了迄今最精准的基本地质素材。

松辽盆地白垩系大陆科学钻探松科2井钻遇地层界面及岩性剖面预测

在松辽盆地白垩纪大陆科学钻探松科2井实施前,以钻井地质设计为基础,结合区域地层特征、地球物理资料和邻井钻探结果,参照油气勘探生产标准和经验,对松科2井钻遇主要界面深度进行预测,建立基本框架,同时预测全井段岩性序列、可能的油气水情况和故障层段,最终建立松科2井综合模拟柱状图。各主要地层界面预测深度为:嫩江组二段顶面(T_06)950m,姚家组顶面(T_1)1 245m,泉头组顶面(T_2)1 680m,登娄库组顶面(T_3)2 530m,营城组顶面(T_4)2 965m,沙河子组顶面(T_4-1)3 320m,火石岭组顶面(T_4-2)5 670m,基底顶面(T_5)6 240 m。岩性剖面的预测主要分为两部分:(1)T_4-1之上参考邻井宋深3井钻遇岩性序列;(2)T_4-1之下则根据地震剖面、其他钻遇相当层位的邻井和区域地层特征综合预测。主要目的层岩性特征如下:营城组上部为粗砂岩、砾岩、砂砾岩,下部为厚层凝灰岩、安山玄武岩、流纹岩夹泥岩,底部为砾岩;沙河子组为泥岩夹煤线、细砂岩、粉砂岩和泥质粉砂岩;火石岭组上部为凝灰岩、泥岩、英安岩和安山岩,下部为泥岩夹细-粉砂岩,含煤;基底为极低级或高级成岩的石炭—二叠系沉积地层。松科2井模拟柱状图是钻探工程施工的主要依据,同时也为其他科学钻探工程模拟柱状图的编制提供借鉴。

松辽盆地徐家围子断陷沙河子组顶界面特征研究——基于松辽盆地大陆科学钻探松科2井

为精确划分松辽盆地沙河子组层序地层,限定断陷期沙河子组与营城组地层时代,进而研究断陷期盆地的演化,笔者利用松辽盆地大陆科学钻探松科2井获取的下白垩统地层岩芯资料,从岩芯尺度对沙河子组与营城组界面进行揭示,结合过松科2井地震剖面解释、松科2井及邻井测井响应特征分析和岩芯精细描述,总结出沙河子组顶界面在不同尺度的具体特征:(1)在地震剖面尺度,其表现为明显上超的特征;(2)在测井曲线上,界面附近表现为由下到上自然伽马曲线变化幅度增大,双侧向电阻率曲线由低值变为中高值的特征;(3)岩芯尺度上,表现为细粒沉积的砂泥岩突变为砾岩或火山岩。