大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位

目的:研究大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位,探讨二者的相互作用。方法:采用Western blot检测SK2通道及JP2蛋白在H9c2细胞中的表达,免疫共沉淀鉴定JP2与SK2通道之间的相互作用,免疫荧光标记观察SK2通道和JP2蛋白在H9c2细胞的定位。结果:心肌细胞H9c2表达SK2通道及JP2蛋白,SK2通道和JP2蛋白可形成免疫复合物,SK2通道和JP2蛋白存在部分共定位。结论:心肌细胞H9c2中SK2通道与JP2蛋白存在相互作用。

小电导钙激活钾通道SK2在容量超负荷心力衰竭大鼠窦房结表达的改变

目的观察小电导钙激活钾通道SK2通道在心力衰竭(HF)大鼠窦房结组织中表达的改变。方法以腹主动脉-下腔静脉穿刺造瘘术建立容量超负荷心力衰竭大鼠模型(n=7),假手术对照组(SO)大鼠切开腹腔,穿刺腹主动脉,但不造成腹主动脉-下腔静脉之间的瘘(n=7)。于术后8周通过超声心动图测定左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)、左心室收缩末内径(left ventricular end-systolic diameter,LVEDs)、左心室舒张末内径(left ventrieular end-diastolic diameter,LVEDd),并于取材时测定心脏质量/体质量(heart weight/body weight),评价心脏结构与功能改变。分离大鼠窦房结细胞以免疫荧光染色法观察SK2通道蛋白的表达,同时取材窦房结组织,提取组织蛋白,行Western blot测定比较心衰大鼠窦房结组织SK2通道表达的改变情况。结果超声心动图结果显示,心力衰竭大鼠心脏收缩功能与舒张功能明显减低[LVEDd(mm):SO 5.91±0.36 vs HF 11.15±0.91,P<0.01;LVEDs(mm):SO 2.89±0.28 vs HF 7.89±0.70,P<0.01;LVEF(%):SO 87.10±1.63 vs HF 62.10±2.57,P<0.01;LVFS(%):SO51.27±2.03 vs HF 30.05±1.66,P<0.01],心脏质量/体质量明显增大(SO 244.19±36.87 vs HF 593.21±28.72,P<0.01)。单细胞免疫荧光染色结果示SK2通道表达于两组大鼠窦房结细胞膜上,Western blot定量分析结果示心力衰竭组大鼠窦房结组织SK2通道蛋白表达水平较假手术组明显减低(0.22±0.10 vs 0.31±0.16,P<0.05)。结论 SK2通道在心力衰竭大鼠窦房结组织中表达明显下调。

高血压大鼠心肌2型小电导-Ca2+-激活-K+通道蛋白（SK2）表达的变化

目的:观察高血压大鼠心肌细胞2型小电导-Ca^2+-激活-K^+(SK2)通道蛋白表达情况。方法:12只健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组(5只)和实验组(7只),实验组采用N’-硝基-L-精氨酸(L-NNA 15 mg/(kg·d))腹腔注射制备高血压模型,对照组以等体积生理盐水腹腔注射,每天称量大鼠体重,每周测量血压及心电图变化,4周后处死大鼠取心脏;采用Western blot的方法检测心肌SK2通道蛋白表达水平。结果:给药4周后,与对照组相比,实验组大鼠血压明显升高(P<0.05),心电图QRS时长和R-R间期延长,实验组大鼠心房组织和心室组织SK2通道的表达均明显升高(1.12±0.18 vs 0.52±0.99,1.64±0.26 vs 0.99±0.22,P<0.05)。结论:高血压模型大鼠心房和心室SK2通道表达增加,其可能是导致高血压模型大鼠出现心律失常的机制之一,为高血压疾病的治疗和预后提供新的思路和策略。

Synaptobrevin-2促进心房肌SK2通道转运的机制研究

小电导钙激活钾通道亚型2(SK2通道)主要在心房表达,与心房颤动有关.高频刺激模拟心房快速起搏可以增加SK2电流,但是其中的机制并不完全清楚.本研究旨在研究转运调节蛋白Synaptobrevin-2(VAMP2)在调节心房肌细胞膜SK2通道转运过程中的作用.以培养的新生大鼠(Rattus norvegicus)心房肌细胞(NRAMs)和表达有SK2通道的HEK293细胞为研究对象,采用蛋白质印迹、膜片钳、共聚焦显微成像、流式细胞术和全内荧光反射等技术研究VAMP2对SK2通道转运的影响.结果发现,快速起搏可上调VAMP2蛋白和增加SK2通道蛋白在细胞膜上的表达,而敲低VAMP2可降低NRAMs细胞膜上SK2通道蛋白的表达.在HEK293细胞上共表达VAMP2和SK2,增加了SK2的表达,加速了SK2向细胞膜的转运,并通过抑制SK2内吞来稳定SK2通道蛋白在细胞膜上表达.由以上结果可知,VAMP2可能通过促进SK2通道的表达,转运和稳定细胞膜上的表达,参与快速起搏心房肌细胞SK2功能的增强.

慢性心衰大鼠心肌2型小电导-Ca^(2+)-激活K^+通道及Junctophilin 2表达的改变

目的:检测慢性心力衰竭模型大鼠心肌细胞膜2型小电导-Ca^(2+)-激活K^+(SK2)通道和Junctophilin 2(JP2)蛋白表达的变化,为人类心力衰竭机制的研究和针对性的治疗提供新思路。方法:10只健康成年SD大鼠随机分为假手术组(5只)和手术组(5只),手术组采用腹主动脉缩窄的方法制备慢性心衰模型,假手术组大鼠分离腹主动脉后不进行缩窄术。每周观察各组大鼠心电图的变化,称量大鼠的体重,之后杀死大鼠取心脏和肺称重,计算心脏重量指数和肺系数;提取心脏组织蛋白,用Western blot的方法检测心肌SK2通道和JP2蛋白的表达水平。结果:术后第8周,手术组大鼠心电图ST段抬高或T波高耸;并且与假手术组相比,手术组大鼠心脏重量指数和肺系数均显著增加;心肌组织SK2通道的表达显著增加,JP2表达下降(P均<0.05)。结论:慢性心衰模型大鼠心肌JP2蛋白表达减小,SK2通道表达增加。

SK2和JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建SK2和JPH2双基因重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2,并检测其在转染后HEK293细胞中的表达。方法:以p CMV6-entry/SK2为模板,PCR扩增出SK2片段,通过BgⅢ/HindⅢ酶切位点克隆入真核表达载体p IRES-EGFP,将JPH2序列插入构建的SK2表达载体p IRES-EGFP-SK2,并通过酶切及测序鉴定。脂质体转染法将重组质粒p IRES-EGFP/SK2+JPH2转染HEK293细胞,采用Western blot法检测SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表达。结果:构建的重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2经酶切和测序鉴定,证实插入的序列与Gen Bank中的SK2和JPH2基因序列完全相同。p IRES-EGFP/SK2+JPH2质粒转染HEK293细胞48 h后,SK2和JPH2蛋白均能成功表达。结论:成功构建了重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2。