SKI-Ⅱ促胃癌SGC7901细胞凋亡的实验研究

目的:研究鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SphK)抑制剂SKI-Ⅱ对人胃癌SGC7901细胞凋亡的影响,并探讨其具体作用机制。方法:常规培养人胃癌SGC7901细胞,SKI-Ⅱ单用或联合顺铂(DDP)干预,流式细胞术检测细胞凋亡率;电镜下观察用药后细胞超微结构的改变;免疫细胞化学、Western blot检测药物作用后细胞中Sphk1、NF-κB、Bcl-2、Bax的表达。Pearson相关分析检测Sphk1与NF-κB、NF-κB与Bcl-2表达的相关性。结果:SKI-Ⅱ单用或联合DDP干预48 h后,SKI-Ⅱ5μmol/L组、SKI-Ⅱ10μmol/L组、DDP 2.5 mg/L组、DDP 2.5 mg/L+SKI-Ⅱ5μmol/L组和DDP 2.5 mg/L+SKI-Ⅱ10μmol/L组细胞凋亡率分别为(40.39±1.06)%、(45.58±0.75)%、(47.27±1.13)%、(53.64±1.11)%和(66.98±2.32)%。与阴性对照组比,差异均有统计学意义(P<0.05);电镜下观察到SGC7901细胞胞浆内出现凋亡小体;SGC7901细胞中Bax阳性表达率增加,Sphk1、NF-κB、Bcl-2阳性表达率减少。Sphk1与NF-κB、NF-κB和Bcl-2的表达呈正相关。结论:SKI-Ⅱ可以通过抑制细胞中Sphk1的表达从而下调NF-κB的表达,并升高Bax/Bcl-2的比例诱导人胃癌SGC7901细胞的凋亡。

SKI-Ⅱ增敏顺铂对SGC7901/DDP细胞周期的阻滞作用研究

目的探讨神经鞘鞍醇激酶1(Sphk1)抑制剂SKI-Ⅱ增敏顺铂(DDP)对SGC7901/DDP细胞周期的阻滞作用,并探讨其可能作用机制。方法将人胃腺癌耐DDP细胞株SGC7901/DDP进行体外培养后,分对照组、DDP组(DDP 2.50 mg/L)、SKI-Ⅱa组(SKI-Ⅱ1.25μmoL/L)、SKI-Ⅱb组(SKI-Ⅱ10.00μmoL/L)、SKI-Ⅱc组(SKI-Ⅱ1.25μmoL/L+DDP 2.50 mg/L)、SKI-Ⅱd组(SKI-Ⅱ10.00μmoL/L+DDP 2.50 mg/L)进行实验。采用MTT、流式细胞技术检测各组细胞生长、周期阻滞情况;免疫组化染色、Western blot法检测细胞Sphk1、P-gp、p27蛋白表达;并分析Sphk1与P-gp、p27蛋白的相关性。结果 DDP组、SKI-Ⅱa组对细胞生长、细胞周期无影响;与对照组比较,SKI-Ⅱc组可抑制细胞生长,使停滞于G0/G1的细胞增加、S期细胞降低(P<0.05)。与对照组比较,DDP组的Sphk1、P-gp、p27蛋白阳性表达率无统计学差异,SKI-Ⅱa组p27蛋白阳性表达率升高(P<0.05)。Pearson相关分析显示,Sphk1与P-gp呈正相关(r=0.550,P<0.01),与p27呈负相关(r=-0.663,P<0.01)。Western blot检测显示,DDP组未见明显改变,SKI-Ⅱb组、SKI-Ⅱd组的Sphk1、P-gp表达减弱,p27表达增强。结论 SKI-Ⅱ可通过抑制Sphk1蛋白下调P-gp蛋白、上调p27蛋白表达,增敏DDP对SGC7901/DDP细胞的周期阻滞作用。

SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的观察SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,并对其机制进行初步研究。方法常规培养胃癌SGC7901细胞,给予不同浓度SKI-Ⅱ及顺铂(DDP)干预,MTT法测定各组胃癌SGC7901细胞增殖情况,免疫组化和Western blot检测药物对SphK1、VEGF表达的影响。结果 MTT检测显示SGC7901细胞与不同浓度的SKI-Ⅱ共同培养,细胞的生长受到不同程度的抑制,其作用具有剂量依赖性,并随时间的延长逐渐增强,免疫组化及Western blot检测显示SKI-Ⅱ可显著下调肿瘤细胞SphK1和VEGF蛋白的表达,单用DDP对SphK1、VEGF无作用。结论 SKI-Ⅱ可以通过下调VEGF和SphK1蛋白表达而有效抑制胃癌SGC7901细胞增殖。

SKI-Ⅱ抑制Sphk1的表达对胃癌细胞株SGC7901细胞周期的影响

目的研究SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞周期的阻滞作用,并探讨其相关分子机制。方法常规培养胃癌SGC7901细胞,SKI-Ⅱ单用或联合顺铂干预,流式细胞术检测细胞周期;免疫细胞化学、Western-blot检测药物作用后细胞中Sphk1、P27的表达。结果 SKI-Ⅱ单用或联合顺铂干预48 h后,各用药组细胞周期停滞在G0/G1期比例增多,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);联合用药组比SKI-Ⅱ单用组作用明显(P<0.05);SGC7901细胞中P27阳性表达率增加,Sphk1阳性表达率减少,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析显示:SGC7901细胞中Sphk1与P27的表达呈负相关。结论 SKI-Ⅱ通过抑制Sphk1的表达进而上调P27的表达诱导肿瘤细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞增殖。

SphK1及其抑制剂对人胃癌裸鼠移植瘤的作用

目的研究鞘氨醇激酶-1（sphingosinekinase-1，SphKl）及其抑制剂在人胃癌裸鼠移植瘤生长中的作用，并探讨其作用机制。方法对数生长期SGC7901细胞注射于裸鼠皮下建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，建模成功后将裸鼠随机分为4组（每组8只），分别用生理盐水、SKI-Ⅱ、顺铂（DDP）、SKI-Ⅱ联合DDP进行治疗，每周注射1次，共3次。定期测量肿瘤体积，绘制肿瘤时间-体积生长曲线。在治疗结束后的第7天脱颈处死裸鼠，取瘤体组织，免疫组化法检测瘤体内SphKl、Bax、Bcl-2蛋白的表达，TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡。结果成功构建了人胃癌裸鼠移植瘤模型。SKI-Ⅱ联合DDP较SKI-Ⅱ、DDP更显著地减少肿瘤组织SphK1、Bcl-2蛋白的表达（P〈0．05），并增加Bax蛋白的表达（P〈0．05），且更明显地增加了肿瘤细胞的凋亡率并抑制了肿瘤的生长（P〈0．05）。结论SphK1通过引起胃癌细胞内Bax／Bcl-2比值的降低，在胃癌的生长过程中发挥了抑制胃癌细胞凋亡、促进肿瘤生长的作用，SphK1抑制剂SKI—Ⅱ与DDP有协同抗肿瘤作用。

SphK1在人胃癌裸鼠移植瘤生长中的作用研究

目的研究鞘氨醇激酶-1（sphingosine kinase-1，SphK1）在人胃癌裸鼠移植瘤生长中的作用，并探讨其机制。方法将培养至对数生长期的SGC7901（人胃癌）细胞注射于裸鼠皮下，建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，建模成功后将裸鼠随机分为4组，每组8只，分别用生理盐水、SKI—Ⅱ、顺铂（DDP）、SKI-Ⅱ联合DDP对移植瘤进行干预，每周腹腔注射1次，共3次。定期测量肿瘤体积，绘制肿瘤时间一体积生长抑制曲线。在治疗结束后的第7天脱颈处死全部裸鼠，取下瘤体组织，Westernblot法及免疫组化法检测瘤体内SphK1、Bax、Bc1-2蛋白的表达情况，原位末端标记染色（TUNEL）法检测肿瘤组织细胞凋亡。结果成功构建了人胃癌裸鼠移植瘤模型，SKI-Ⅱ单独及联合顺铂应用于荷瘤裸鼠后，均能通过抑制SphKl蛋白的表达增加Bax／Bcl-2的比值，且联合用药组能较SKI-Ⅱ组和顺铂组更显著地减少肿瘤组织SphKl、Bcl-2蛋白的表达（P〈0．05），并增加Bax蛋白的表达（P〈0．05）。SKI-Ⅱ联合DDP组更明显地抑制了肿瘤的生长（P〈0．05）。结论SphKl通过调节Bax／Bel-2的比值起到影响胃癌生长的作用，胃癌细胞中SphKl的表达被抑制后，通过引起Bax／Bel-2比值的升高，进而产生了诱导胃癌细胞凋亡、抑制肿瘤生长的作用。SphKl的特异性抑制剂SKI-Ⅱ不仅可单独应用达到抑制胃癌生长的目的，且与DDP联合应用可发挥协同抗肿瘤作用。