丙戊酸钠对骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1作用及其机制的研究

本研究探讨丙戊酸钠(sodium volproate,VPA)对骨髓增生异常综合征细胞SKM-1的作用及其机制。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测VPA对细胞生长的抑制作用;采用流式细胞术检测不同浓度VPA作用后细胞凋亡的比例;采用RT-PCR技术检测c-flipl、c-flips及dlk1 mRNA表达的变化。结果发现,VPA对于SKM-1细胞生长具有抑制作用,且随时间的延长及浓度增高而增强;流式细胞术检测显示,细胞凋亡率随着VPA浓度的增加而增加;VPA可使SKM-1细胞中c-flipl、c-flips及dlk1mRNA表达明显降低,且随着VPA浓度增加而加重。结论:VPA可以通过促进细胞凋亡抑制SKM-1细胞增殖,c-flipl、c-flips及dlk1基因表达的改变可能在这一过程中发挥了重要作用。

地西他滨联合全反式维甲酸对SKM-1 MDS细胞株的体外研究

目的:探讨去甲基化制剂地西他滨和全反式维甲酸对MDS-RAEB细胞株SKM-1的体外影响及其机制。方法:SKM-1细胞经药物处理后,用台酚蓝拒染法观察SKM-1细胞生长曲线的变化;用硝基四氮唑蓝还原试验和流式细胞术观察药物对SKM-1细胞的诱导分化作用;用Annexin Ⅴ-FITC标记了解细胞的早期凋亡;用RT-PCR研究细胞DNMT3A和P15INK4B基因表达的变化。结果:地西他滨和ATRA抑制SKM-1细胞生长,增强SKM-1细胞的还原能力,增加细胞表面CD14、CD11b表达,促进细胞凋亡,两药联合应用具有协同作用;地西他滨可使SKM-1细胞P15INK4B mRNA表达增加,DNMT3A mRNA表达减少。结论:地西他滨和ATRA均可以促进SKM-1细胞凋亡和分化,二者有协同作用;地西他滨的作用可能与DNMT3A和P15INK4B基因表达有关。

苦参碱诱导MDS细胞株SKM-1凋亡作用的研究

目的:研究苦参碱诱导骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1的凋亡作用及其机制。方法:采用WST-1法检测不同浓度的苦参碱对SKM-1细胞生长的抑制作用;应用流式细胞术检测早期凋亡细胞以及线粒体跨膜电位的变化;用分光光度法检测caspase-9活性。结果:0.25～2.0mg/ml苦参碱对SKM-1细胞有生长抑制作用,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);苦参碱处理48小时后,细胞凋亡率明显增加,并呈剂量依赖性(P<0.05);1.0mg/ml苦参碱处理后48小时内,细胞线粒体跨膜电位逐渐降低,caspase-9活性逐渐升高,呈时间依赖性(P<0.01)。结论:苦参碱可能通过降低细胞线粒体跨膜电位、激活caspase-9而诱导SKM-1细胞早期凋亡。

慢病毒介导的TET2基因稳定敲低SKM-1细胞株的构建及验证

目的:构建稳定敲低TET2基因的SKM-1细胞株,将包装好的H_TET2-shRNA慢病毒感染SKM-1细胞株,得到H_TET2-shRNA SKM-1稳定株。方法:将稳定敲低的SKM-1细胞株进行qPCR和Western blot实验验证。利用CCK-8细胞活力检测试剂盒和流式细胞术分别检测转染前后SKM-1细胞的增殖活性和凋亡情况。结果:qPCR验证H_TET2-shRNA的SKM-1细胞中TET2基因表达量明显降低;Western blot表明H_TET2-shRNA的SKM-1细胞中TET2蛋白表达量也明显降低;利用CCK-8细胞活力检测证实了TET2基因稳定敲低后并不影响细胞的活力;细胞周期检测发现敲低TET2后S期细胞占总细胞数的48.1%,高于SKM-1组(42.3%)和对照空质粒组;细胞凋亡检测发现TET2敲低组SKM-1细胞凋亡率为0.6%,低于空质粒组的4.4%。结论:通过慢病毒介导构建TET2基因稳定低表达的SKM-1细胞株,利用PCR、Western blot实验验证成功构建细胞株,利用CCK-8细胞活力检测证实TET2基因稳定敲低后并不影响细胞活力;流式细胞术细胞周期检测发现TET2基因敲低会影响细胞DNA复制功能,导致细胞间期分裂异常,影响细胞生长和自我修复;流式细胞术细胞凋亡检测发现TET2基因敲低会抑制细胞凋亡,这可能与TET2是抑癌基因相关。

三氧化二砷通过抑制血管内皮生长因子mRNA表达抗骨髓增生异常综合征血管新生作用的初步研究

目的探讨三氧化二砷通过下调人脐静脉内皮细胞和SKM-1人骨髓增生异常综合征细胞株(SKM-1细胞株)的血管内皮细胞生长因子mRNA表达,具有抗骨髓增生异常综合征血管新生作用。方法采用逆转录-聚合酶链反应扩增血管内皮细胞生长因子的方法。观察:①不同浓度As2O3对A组(人脐静脉内皮细胞)、B组(经SKM-1细胞株上清液干预人脐静脉内皮细胞)及C组(SKM-1细胞株)血管内皮生长因子mRNA的影响。②相同浓度下,三氧化二砷分别干预A、B及C 3组12、24、36、48、60、72 h后,其对血管内皮生长因子mRNA的影响。结果①随着三氧化二砷作用浓度的增加,A、B、C 3组血管内皮生长因子mRNA表达显著下降,并呈负性相关关系(t=8.636、2.560、13.002,P<0.001);②随着三氧化二砷作用浓度和时间的增加,A、B及C 3组的血管内皮生长因子mRNA表达均逐渐下降,呈显著的负性相关关系(P<0.05);③对A、B组表达结果进行比较B组血管内皮生长因子mRNA表达高于A组,差异有统计学意义(t=3.400,P<0.05)。结论三氧化二砷可通过下调人脐静脉内皮细胞和SKM-1细胞株的血管内皮生长因子转录和翻译过程而实现抗血管新生作用,提示骨髓增生异常综合征细胞可能分泌上调血管内皮细胞中血管内皮生长因子基因表达的物质,具有促进血管新生作用。