宫颈癌组织中转录因子Skn-1 a cDNA的克隆及表达

目的:从宫颈癌组织中扩增与上皮细胞分化和人乳头瘤病毒(HPV)基因表达相关的转录因子Skn-1acDNA,进而在真核细胞中表达该转录因子以了解其功能。方法:从宫颈癌组织中提取总RNA,以此为模板,RT-PCR扩增Skn-1acDNA片段,将该cDNA片段克隆至pMD18-T载体并进行序列分析,构建Skn-1a真核表达载体,并转染Hela细胞,检测其表达情况。结果:RT-PCR扩增得到约1 300 bp的cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,DNA测序表明,得到片段长度为1 308 bp,为转录因子Skn-1a基因编码的cDNA,获得的Skn-1acDNA序列与已公布的Skn-1acDNA序列具有99.85%同源性,有1个碱基的差异,但并未导致编码氨基酸的改变,继而构建了Skn-1a真核表达载体pcDNA3/Skn-1a,其转染Hela细胞后可正确表达。结论:转录因子Skn-1a在宫颈癌组织中有一定量的表达,并在体外培养的Hela细胞中获得表达。

转录因子Skn-1a激活人乳头瘤病毒18 E6基因表达的分析

用脂质体介导真核表达质粒pcDNA3-skn-1a转染Hela细胞,实时定量PCR检测HPV18 E6基因的表达量,以探讨转录因子Skn-1a对HPV18 E6基因表达的调控.结果显示Skn-1a能够显著激活HPV18 E6基因表达,为高发宫颈癌E6基因调控的分子机理探讨提供理论依据.

白术乙醇提取物对秀丽隐杆线虫寿命的影响及其机制研究

目的:研究白术乙醇提取物(AM)对秀丽隐杆线虫(简称“N2线虫”)寿命的影响,并基于转录因子SKN-1/核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路探讨其作用机制。方法:将N2线虫分为空白对照组、阳性对照组(100μmol/L姜黄素,下同)和AM低、中、高剂量组(100、200、300μg/mL,下同),考察正常、氧化应激(40 mmol/L H2O2)条件下AM对N2线虫寿命的影响(以平均存活时间计)以及正常条件下AM对N2线虫繁殖能力的影响(以子代数量计)。用700μmol/L H2O2建立小鼠神经瘤母细胞N2a氧化应激模型,采用MTT法考察阳性对照和AM低、中、高剂量对模型细胞存活率的影响。人胚胎肾上皮细胞293T转染Nrf2-抗氧化反应元件(ARE)质粒后,采用荧光素酶报告基因法考察阳性对照和AM低、中、高剂量作用24 h以及AM中剂量作用12、18、24 h对Nrf2-ARE荧光素酶活性的影响。采用实时定量聚合酶链式反应法考察阳性对照和AM低、中、高剂量对N2a细胞中Nrf2下游抗氧化基因NQO-1、HO-1 mRNA表达以及对N2线虫中SKN-1下游抗氧化基因GCS-1、GST-7、GST-10、HSP-60、HSP-16.2、SOD-3 mRNA表达的影响。结果:与空白对照组比较,阳性对照组和AM各剂量组N2线虫在正常、氧化应激下的平均存活时间均显著延长,第1天子代数量(除AM高剂量组外)、第2天子代数量(除AM低剂量组外)和总子代数量(除AM低剂量组外)均显著增加(P<0.05或P<0.01)。阳性对照组和AM中、高剂量组N2a细胞存活率显著高于模型组(P<0.05或P<0.01)。与空白对照组比较,阳性对照组和AM各剂量组293T细胞中Nrf2-ARE荧光素酶相对活性以及AM中剂量组293T细胞培养不同时间的Nrf2-ARE荧光素酶相对活性均显著增强(P<0.01),并有剂量依赖性和时间依赖性趋势。与空白对照组比较,阳性对照组和AM各剂量组N2a细胞/线虫中HO-1、NQO-1(除阳性对照组外)、GCS-1(除AM低剂量组外)、GST-7(除阳性对照组和AM低剂量组外)、GST-10、HSP-60(除AM低剂量组外)、HSP-16.2(除阳性对照组和AM低剂量组外)、SOD-3(除阳性对照组和AM低剂量组外)mRNA的相对表达量均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:AM可延长N2线虫在正常和氧化应激状态下的寿命,并可提高线虫的繁殖能力,其作用机制可能与激活SKN-1/Nrf2信号通路有关。

茯苓多糖在秀丽隐杆线虫中的抗氧化和抗衰老作用及其作用机制

目的分析茯苓多糖成分对秀丽隐杆线虫体内抗氧化和抗衰老作用的影响,并阐明其潜在机制。方法将L4期线虫随机分为低、中、高剂量(10、20、40μg/mL)的茯苓多糖组和空白组进行培养;采用百草枯抗氧化实验、寿命实验、脂褐素测定实验、应激实验(紫外/高温)、生理功能实验(吞咽频率/摆动次数/产卵量)探究茯苓多糖对野生型秀丽隐杆线虫抗氧化和抗衰老作用;将突变体线虫分为茯苓多糖组(40μg/mL)和空白组,采用应激实验、寿命实验、线虫BZIP结构域蛋白1(protein skinhead-1,skn-1)绿色荧光蛋白的细胞定位检测、qRT-PCR实验、活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测探究茯苓多糖的抗衰老的作用机制。结果茯苓多糖显著延长线虫的寿命,减少脂褐素的产生,增强对紫外线和热胁迫的抵抗力,提高咽部泵血频率和运动能力,显示出显著的抗衰老生物活性。茯苓多糖的抗衰老作用是通过skn-1信号通路介导的,而不依赖于胰岛素样受体β亚基(insulin-like receptor subunit beta,daf-2)和神经元乙酰胆碱受体亚基eat-2(neuronal acetylcholine receptor subunit eat-2,eat-2)信号通路。茯苓多糖增加了线虫中skn-1转录因子的核定位,上调了下游抗氧化基因谷胱甘肽S-转移酶4(glutathione S-transferase 4,gst-4)和gst-7的转录水平,并显著降低了细胞内ROS水平。然而,在skn-1突变体蠕虫中未观察到这些效应。结论茯苓多糖在秀丽隐杆线虫中表现出抗氧化和抗衰老的作用,其机制涉及调控skn-1转录因子及其下游抗氧化基因,最终降低ROS水平,增强机体的抗氧化应激能力。