NDUFA4通过增强线粒体活化水平促进卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移及侵袭

目的:探讨NDUFA4介导线粒体活化水平对卵巢癌细胞SKOV3增殖、迁移及侵袭的影响。方法:以慢病毒技术建立SKOV3细胞的NDUFA4过表达和沉默模型;CCK-8检测细胞增殖,细胞划痕检测细胞迁移,Transwell检测细胞侵袭,流式细胞术检测线粒体膜电位和凋亡;Real-time PCR检测线粒体DNA(mtDNA)拷贝数,MT-ND1、MT-ND5、MT-CYB、SDHA、PGC-1α、NRF1和mTFA mRNA的表达;电镜观察线粒体形态,分光光度法检测Complex IV活性水平;Western blot检测PGC-1α、NRF1、mTFA蛋白的表达。结果:SKOV3细胞中实现NDUFA4的过表达和沉默;NDUFA4的过表达提高细胞增殖、侵袭和迁移能力(P<0.05),上调mtDNA拷贝数,上调MT-ND1、MT-ND5、MT-CYB、SDHA、PGC-1α、NRF1和mTFA mRNA水平(P<0.05),上调PGC-1α、NRF1和mTFA蛋白水平(P<0.05),上调线粒体膜电位水平以及Complex IV活性水平(P<0.05),线粒体变多形态正常。而NDUFA4的沉默则相反,线粒体出现空泡化。结论:NDUFA4可能通过加强线粒体的活化和氧化磷酸化的水平在SKOV3细胞中发挥促癌功能。

建立卵泡刺激素受体单位点基因突变体的卵巢癌SKOV3细胞和裸鼠模型

目的建立转染卵泡刺激素受体(FSHR)307和680位点突变的上皮性卵巢癌SKOV3细胞系和裸鼠动物模型。方法将人卵巢颗粒细胞(来自体外受精取卵时废弃的颗粒细胞),行原代培养后用于FSHR RNA提取;FSHR和FSHR307、680位点突变重组蛋白构建;将FSHR和FSHR307、680位点突变蛋白转染SKOV3细胞株;将处理后的3组SKOV3细胞接种到裸鼠皮下,8周后处死裸鼠,并取瘤组织验证。结果建立了307和680位点突变的FSH受体高表达的上皮性卵巢癌SKOV3细胞系和裸鼠动物模型。结论成功地建立了307和680位点突变的FSH受体高表达的SKOV3上皮性卵巢癌细胞系和裸鼠移植瘤模型,为FSH在上皮性卵巢癌中的作用和治疗提供了一种新的细胞模型和动物模型。

体外靶向PI3K基因RNA干扰对卵巢癌SKOV3细胞Akt表达的影响

目的采用RNA干扰技术沉默卵巢癌SKOV3细胞中PI3K/Akt信号转导通路中关键基因PI3Kp110α,观察其对PI3K/Akt信号通路下游信号蛋白Akt的影响,以期为卵巢癌的基因治疗提供可靠的理论依据。方法体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,脂质体介导靶向P13Kp110α基因的小干扰RNA(siRNA)转染卵巢癌SKOV3细胞,采用荧光定量PCR法检测干扰后PI3K、Akt mRNA的表达,免疫荧光双标法观察RNA干扰48 h后对PI3K、Akt蛋白的影响。结果 Real-time PCR结果示RNA干扰组PI3K、Akt mRNA相对含量显著低于空白载体组和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而空白载体组与对照组表达差异无统计学意义(P>0.05);免疫荧光细胞化学结果示RNA干扰组的PI3K、Akt蛋白阳性率较对照组与空白载体组明显减少,而对照组与空白载体组比较无明显差异。结论 siRNA可沉默卵巢癌SKOV3细胞P13Kp110α基因的表达,同时减轻PI3K蛋白及下游信号蛋白Akt的表达,以PI3Kp110α为靶点的RNA干扰技术可望成为卵巢癌基因治疗的新策略。

RNA干扰PI3K基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的采用RNA干扰技术沉默人卵巢癌SKOV3细胞中PI3K/AKT信号转导通路中PI3Kp110α基因,观察其对SKOV3细胞增殖的影响,以期为卵巢癌的基因治疗提供可靠的理论依据。方法体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,脂质体介导靶向P13Kp110α基因的小干扰RNA(siRNA)转染人卵巢癌SKOV3细胞,采用免疫荧光双标法观察RNA干扰48h后对PCNA蛋白、CyclinD1蛋白的影响。结果 RNA干扰组PCNA蛋白、CyclinD1蛋白阳性率较对照组与空白载体组明显减少,而对照组与空白载体组相比无明显差别。结论 RNA干扰P13Kp110α基因可下调PCNA蛋白、CyclinD1蛋白的表达,抑制细胞增殖,这种调控可能是通过PI3K/AKT信号通路及其下游靶分子进行的。以PI3Kp110α为靶点的RNA干扰技术有望成为卵巢癌基因治疗的新策略。

CIK细胞联合顺铂对卵巢癌耐药细胞SKOV3/CDDP的杀伤作用

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞联合顺铂对卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/CD-DP小鼠腹腔移植模型的体内外杀伤作用。方法:取正常人的外周血单个核细胞(PBMC),加入IFN-γ、IL-2、CD3McAb和IL-1,体外诱导成CIK细胞。用MTT法测定CIK细胞、顺铂及两者联合对人卵巢癌细胞株SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性。在SCID小鼠腹腔内接种卵巢癌SKOV3/CDDP细胞,观察CIK细胞对荷瘤鼠的体内抑瘤作用,并用RIA法检测各组血清中CA125的含量。结果:顺铂对SKOV3/CDDP细胞的IC50为315.5μg/ml,较其对SKOV3细胞的IC50(85μg/ml)增加了4倍;CIK细胞对SKOV3与SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性均在48h最高,且随效靶比的增高而增强,其对SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性明显高于SKOV3(P<0.05)。仅25μg/ml的顺铂即可使效靶比为12.5∶1组中的联合杀伤率比单纯顺铂组增加5.8倍,比单纯加CIK(相同效靶比)细胞杀伤率增加2.3倍,且随效靶细胞比值和顺铂浓度的升高呈依赖性增加。与对照组相比,CIK组与CIK+顺铂组均能显著抑制癌性结节的生长,抑瘤率达100%,且3组SCID鼠血中CA125值有显著性差异(P<0.05)。结论:正常人CIK细胞联合顺铂对清除晚期卵巢癌表达耐药蛋白的腹腔种植转移病灶可能会有较好的效果,并有希望成为前景良好的综合治疗方案。

RhoA在卵巢癌细胞SKOV3体外侵袭和迁移过程中的作用

目的:探讨RhoA在卵巢癌细胞SKOV3体外侵袭和迁移过程中的作用。方法:构建RhoA真核表达载体,以脂质体介导转染卵巢癌细胞SKOV3,用RT-PCR和Westernblot检测SKOV3RhoAmRNA及蛋白表达水平;Boyden小室体外侵袭实验和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力。结果:转染RhoA的实验组与转染空载体的对照组比较,RhoAmRNA的表达丰度(RhoA/GAPDH)为12.01±1.72,明显高于对照组的6.81±1.24;RhoA蛋白的表达水平(RhoA/β-actin)为4.81±0.56,亦明显高于对照组的3.02±0.32,两者差异都有统计学意义(P<0.05)。Boyden小室体外侵袭实验中实验组与对照组平均侵袭百分数分别为(47.60±1.47)%和(22.60±2.40)%(P<0.05),比较划痕后0h与24h的宽度差,实验组和对照组愈合百分比分别为(65±6.4)%和(54±5.5)%(P<0.05);表明转染RhoA后,细胞侵袭和迁移能力明显增强。结论:RhoA增强了卵巢癌细胞SKOV3体外侵袭和迁移能力。

Nectin-4在卵巢癌细胞株SKOV3中的表达及意义

目的探讨Nectin-4在卵巢癌细胞株SKOV3中的表达及其在体外侵袭和转移中的作用。方法构建Nectin-4真核表达载体,以脂质体介导转染卵巢癌细胞SKOV3,用RT-PCR和免疫组织化学法检测SKOV3 Nectin-4mRNA及蛋白表达水平。结果转染Nectin-4的实验组细胞与转染空载体的对照组细胞比较,Nectin-4 mRNA的表达量差异有统计学意义(0.84±0.09 vs 0.37±0.05,P<0.01);Nectin-4蛋白表达水平差异有统计学意义(0.67±0.10 vs 0.16±0.09,P<0.01)。Boyden小室体外侵袭实验中实验组与对照组平均侵袭百分数分别为(46.0±6.07)%、(25.3±7.56)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Nectin-4增强了卵巢癌细胞SKOV3体外侵袭和转移的能力,其机制与Nectin-4增强细胞的运动能力及增殖能力有关。

重组人抗缪勒氏管激素对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨重组人抗缪勒氏管激素(AMH)对人卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制作用。方法:采用浓度为25、50、100、200、400 nmol/L重组人AMH处理对数生长期的SKOV3细胞,并设阿霉素(DOX)组为阳性对照组,同时设3个阴性对照孔(DOX和AMH浓度0 nmol/L),作用72小时后通过CCK-8法检测SKOV3细胞增殖抑制率;采用重组人AMH 100 nmol/L作用于SKOV3细胞48小时后使用Annexin-V和PI染色,并设1 nmol/L DOX为阳性对照组,同时设3个阴性对照孔(DOX和AMH浓度0 nmol/L),通过流式细胞仪检测AMH对SKOV3细胞的促凋亡作用。结果:浓度100、200、400 nmol/L的AMH对SKOV3细胞增殖抑制率分别为50.6%、64.5%、78.3%,与阴性对照组相比有统计学差异(P<0.01),且随AMH浓度加大,抑制效果明显提高;流式细胞仪检测AMH组SKOV3细胞总凋亡率为(30.6±2.82)%,与阴性对照组比较,细胞凋亡率明显升高,有统计学差异(P<0.01)。结论:重组人AMH在体外能够明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖,促进其凋亡。

土荆皮酸诱导卵巢癌细胞系SKOV3凋亡的实验研究

目的:研究土荆皮酸(PAB)对体外培养的SKOV3细胞的生物学效应和作用机制。方法:用MTT法、流式细胞术、电镜检测体外培养的SKOV3细胞在PAB作用下的增殖抑制及凋亡程度,用RT-PCR法检测P53/Bcl-2/Bax的表达水平。结果:①PAB对SKOV3细胞的增殖抑制作用随浓度升高而明显增强,其IC50约10μmol/L。②流式细胞术证实PAB呈浓度依赖性改变细胞周期分布,一方面降低G0/G1期的细胞比例,另一方面增高G2/M期细胞的比例。③RT-PCR法显示SKOV3细胞在10μmol/LPAB作用12、24、48h均显示Bax上调和Bcl-2的下调,P53则未检测到表达。结论:在体外PAB能抑制SKOV3细胞增殖,诱导其凋亡,其诱导凋亡机制可能与Bax的上调和Bc1-2的下调相关。

癌性腹水对卵巢癌细胞增殖及迁移的影响

目的探讨癌性腹水对卵巢癌腹水中肿瘤细胞和卵巢癌细胞系（SKOV3）的形态学特征、增殖和迁移能力的影响。方法卵巢癌腹水中提取的肿瘤细胞在体外用DMEM高糖培养液培养；卵巢癌细胞系（SKOV3）分别用DMEM高糖培养液和DMEM高糖培养液中加入不同比例癌性腹水制成的混合培养液培养；分别通过光学显微镜和电子显微镜观察各组细胞的形态学特点；用CCK试剂盒检测各组细胞的增殖能力；用划痕实验检测癌性腹水对卵巢癌细胞系SKOV3迁移能力的影响。结果卵巢癌腹水中肿瘤细胞与卵巢癌细胞系（SKOV3）形态学特征明显不同；腹水中的肿瘤细胞离开腹水微环境后增殖能力明显减弱；混合培养液培养的SKOV3肿瘤细胞比DMEM高糖培养液培养的SKOV3肿瘤细胞的增殖及迁移能力明显增强。结论卵巢癌腹水中的肿瘤细胞发生了更有利于其增殖及迁移的形态学改变；癌性腹水对卵巢癌细胞系（SKOV3）的增殖及迁移具有促进作用。

中心体蛋白Nlp对卵巢癌细胞侵袭与黏附能力的影响

目的:探讨中心体蛋白Nlp是否促进卵巢癌细胞增殖、黏附与侵袭。方法:利用转染技术构建Nlp高表达的卵巢癌SKOV3细胞系,采用MTT法、肿瘤细胞黏附、跨膜迁移分析和平板集落形成率检测,比较SKOV3、SKOV3/GFP和SKOV3/Nlp细胞系在增殖、黏附与侵袭能力方面的差异。结果:与对照细胞相比,SKOV3/Nlp细胞的生长加快,SKOV3/Nlp细胞克隆形成率显著上升(P<0.05)。SKOV3/Nlp细胞在30min及60min时黏附率均显著大于SKOV3/GFP及SKOV3细胞(P<0.01)。SKOV3/Nlp、SKOV3/GFP、SKOV3细胞迁移至膜下的数目分别为:640±69,316±25,314±37。与SKOV3/GFP、SK-OV3细胞相比,SKOV3/Nlp细胞的迁移能力显著增强(P<0.05)。结论:当Nlp表达增高后,会导致肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭等恶性表型增加,提示Nlp具有促进肿瘤发生发展的生物学作用。