靶向Skp2基因siRNA对大肠癌细胞生物学特性的影响

目的:设计和构建Skp2特异性的siRNA真核表达载体,观察Skp2siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生物学特性的影响.方法:人工合成Skp2基因干扰序列并定向插入到RNAi真核表达载体pRNAT-U6.1/Neo,通过测序鉴定.用脂质体介导的基因转染方法转入HCT116细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞系,半定量RT-PCR方法检测靶基因的表达.流式细胞技术分析细胞周期分布,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果:测序表明Skp2干扰序列完全正确.RT-PCR结果显示2条Skp2siRNA真核表达质粒均能有效抑制核干细胞因子mRNA的转录表达(P<0.05).MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降(29.21%±1.40%,30.10%±1.50%vs49.05%±4.50%,53.03%±4.92%,均P<0.05).流式细胞术检测结果显示转染后G0/G1期细胞数占生长周期细胞数的比例增多,即表现为G1期阻滞,S期细胞的比例降低.结论:成功构建了Skp2干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞Skp2mRNA表达,细胞增殖能力减弱,为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据.

Skp2基因的研究进展

Skp2被称为S期激酶相关蛋白,属于F-box蛋白家族成员,在蛋白泛素化降解过程中可作为SCF-Skp2复合物的重要成分起识别底物蛋白的作用,主要通过降解细胞周期调节蛋白介导细胞周期调控和细胞增殖。为更全面地了解Skp2的研究进展及开展其在动物科学与医学领域的研究,从Skp2基因的结构、功能、与人类肿瘤致病机理、转录调控和启动子方面的关系进行了综述。

荧光定量PCR技术检测喉鳞状细胞癌标本中Skp2基因表达

目的:探讨细胞S相激酶相关蛋白(Skp2)基因在喉鳞状细胞癌发生、发展中的作用。方法:应用荧光定量逆转录PCR(FQ-PCR)技术检测40例喉鳞状细胞癌及10例癌旁正常组织中Skp2 mRNA拷贝数,并分析其与临床相关因素的关系。结果:40例喉鳞状细胞癌Skp2 mRNA中位拷贝数为6 622.54 copy/μg RNA,10例癌旁正常组织为0 copy/μg RNA,两组差异有统计学意义(P<0.01);喉鳞状细胞癌和癌旁正常组织Skp2 mRNA阳性表达率分别为50%和0,差异有统计学意义(P<0.01)。喉鳞状细胞癌中颈淋巴结转移组Skp2 mRNA中位拷贝数为617 138.4 copy/μg RNA,颈淋巴结无转移组为0 copy/μg RNA,两组差异有统计学意义(P<0.05);喉鳞状细胞癌中颈淋巴结转移组和颈淋巴结无转移组Skp2 mRNA阳性表达率分别为100.00%和35.48%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:Skp2基因可能与喉鳞状细胞癌颈淋巴结转移有关,FQ-PCR为一精确检测喉鳞状细胞癌Skp2 mRNA表达的方法,Skp2 mRNA表达水平可能成为预测喉鳞状细胞癌颈淋巴结转移的更加灵敏的指标。

Skp2基因表达下调对HepG2细胞生物学特性及SP1和p27蛋白表达的影响

目的研究Skp2基因表达下调对HepG2细胞生物学特性及p27和SP1蛋白表达的影响。方法构建Skp2基因干扰慢病毒质粒,包装后感染HepG2细胞,48 h后,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;侵袭小室试验检测细胞侵袭能力;Western blot检测Skp2基因下调后p27和SP1蛋白的表达情况。结果与正常HepG2细胞组相比,Skp2干扰慢病毒组细胞Skp2蛋白的表达明显下调,p27蛋白表达大幅增加,细胞生长速度明显减慢,细胞凋亡率增加近两倍,G0/G1期细胞增多;SP1蛋白表达减少,浸润、迁移的细胞数减少约50%(P<0.05)。结论 Skp2蛋白表达下调抑制了HepG2细胞的增殖,促进HepG2细胞的凋亡,造成细胞侵袭能力减弱。Skp2蛋白表达下调导致p27蛋白表达上调、SP1蛋白表达下调,在上述生物学特性变化中可能发挥了重要作用,为深入探讨肝癌的病理机制奠定了基础。

Skp2 shRNA表达质粒的构建及其对肺癌细胞生长的影响

目的构建Skp2基因的RNAi真核表达质粒,观察其对SPC-A-1肺癌细胞内Skp2基因表达及细胞生长的影响。方法根据GenBank中Skp2cDNA序列设计针对Skp2基因的shRNA序列,合成序列并克隆入pGenSil-1质粒中,构建Skp2 pshRNA重组质粒。脂质体介导重组质粒转染SPC-A-1肺癌细胞。RT-PCR检测肺癌细胞Skp2 mRNA的表达,Western blot检测Skp2蛋白表达。MTT检测各组细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期改变。结果重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功。转染重组质粒的肺癌细胞Skp2 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05),细胞生长增殖受到抑制,阻滞在G0/G1期的细胞比例增加,而进入S期的细胞比例明显下降(P<0.05)。结论构建的Skp2 shRNA表达质粒能有效下调Skp2基因的mRNA及蛋白的表达、抑制细胞的生长增殖。

小麦Ta-SKP2A克隆及其酵母双杂交诱饵载体的构建

SKP2A是调控细胞周期转录因子降解的F-box蛋白。为研究该蛋白在小麦-叶锈菌互作过程的作用,首先克隆获得中国春小麦Ta-SKP2A全长序列,然后将其与pGBKT7载体连接,转入酵母Y187感受态细胞中,构建酵母诱饵表达载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活效应。结果表明,Ta-SKP2A编码区序列长度为1 146 bp,其ORF区编码一条由382个氨基酸组成的多肽。在ORF区两侧连接酶切位点(EcoRⅠ和Bam HⅠ),并将其与载体pGBKT7连接,成功构建了包含目的基因的诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A,且含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,其过夜培养物OD600>0.8,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在二缺、三缺及四缺营养缺陷平板上不能生长,表明诱饵质粒的表达产物不能自激活报告基因。成功构建了一个包含Ta-SKP2A的重组诱饵质粒,为深入筛选与其互作的靶蛋白,研究其在小麦-叶锈菌互作体系中的作用机制奠定了基础。

鸡Skp2实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了建立以及应用鸡细胞S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)的实时荧光定量PCR方法,以鸡Skp2基因为研究对象,根据GenBank中已发表的鸡Skp2和β-actin序列的高度保守区域设计引物,构建重组质粒作为标准品,成功建立了检测鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)中Skp2 mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,并对其Tm值和引物浓度等进行了优化。该方法最优反应体系为20.0μL,包含Real-time PCRMaster mix(2×)10.0μL,上、下游引物(10.0μmol/L)各1.0μL,cDNA 2.0μL,ddH2O 6.0μL;最佳反应条件为95℃预变性10 s,95℃变性5 s,60℃退火/延伸34 s,30个循环。应用该方法对CEF中Skp2 mRNA的表达量进行检测,发现在CEF感染禽网状内皮组织增生病病毒(REV)后,其细胞中Skp2 mRNA表达量均高于对照组,且在24、48、72 h显著增加。研究首次建立了检测鸡Skp2基因的检测方法,该方法稳定性良好,精确度高,特异性强,为进一步定量研究鸡Skp2 mRNA表达及其与细胞周期的关系奠定了基础。