SLAⅠ类基因研究新进展

SLAⅠ类基因编码细胞表面高度多态的糖蛋白,负责将内源性抗原肽递呈给T细胞,激发特异的免疫反应。文章介绍了近年来SLAⅠ类基因分子结构、组织中的表达、表达调节、基因分型、多态性及进化研究的新进展,重点介绍了SLAⅠ类基因分型方法及多态性研究。SLAⅠ类基因分型方法主要包括血清学法、DNA序列测定、PCR-SSP、PCR-SSOP、微卫星法,其中PCR-SSP法快速简便,在SLAⅠ类基因分型研究中应用广泛。文章对SLAⅠ类基因在基因功能、肽疫苗、异种移植等方面的研究和应用前景进行了讨论。

五指山小型猪近交系白细胞抗原Ⅰ类3基因的研究

【目的】为探讨五指山小型猪(WZSP)近交系群体中SLAⅠ3(SLA-3)位点等位基因分布结构及其特性。【方法】利用4对引物,采用RT-PCR扩增了32头WZSPSLA-3基因部分外显子1、外显子2和大部分外显子3序列。根据家系和扩增结果,选择8头个体的PCR产物克隆测序。【结果】获得9个不同的核苷酸序列。与GenBank中所用SLA-3基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较分析,确定这9个序列均为SLA-3位点上的新等位基因,但这些等位基因间核苷酸变异很少;氨基酸序列比较发现猪和人之间有很高的保守性。同时,构建了23个SLA-3的等位基因和1个HLA-A等位基因核苷酸序列的系统树。【结论】WZSP在SLA-3位点和其它猪品种有明显的差异,拥有其独特的遗传资源。从分子水平为WZSPSLA-3基因的分子分型及特异单倍体猪的培育和异种器官移植实验用动物的研究提供理论依据。

胃癌细胞系MKN中HLA-Ⅰ类分子表达降低的机制研究

目的:探讨胃癌细胞系MKN中HLA-Ⅰ类抗原表达水平异常的分子机制。方法:以胃癌细胞系BGC823、MGC803和SGC7901为对照,利用流式细胞仪检测细胞表面HLA-Ⅰ类复合物的表达情况,W estern b lot检测HLA-Ⅰ类分子重链及轻链表达情况,半定量RT-PCR检测HLA-Ⅰ类分子重链、轻链和抗原加工分子mRNA水平的表达情况,并利用HLA基因区域的微卫星序列检测MKN细胞HLA基因在DNA水平的完整性。结果:胃癌细胞系MKN表面HLA-Ⅰ类复合物表达降低,重链A及B/C位点蛋白无表达而轻链表达无异常。在mRNA水平,胃癌细胞系MKN存在重链A、B、C各位点和抗原加工分子TAP1、LMP2、Tapasin、PA28β的表达缺失。微卫星DNA扩增结果初步显示,MKN细胞无HLA基因区域DNA的大片段丢失。结论:胃癌细胞系MKN HLA-Ⅰ类分子复合物表达降低可能是由HLA-Ⅰ类分子重链及其加工分子在转录水平改变而引起的。

携带非A5.1型MHC-Ⅰ类相关分子A穿膜区等位基因中晚期食管癌患者对NK细胞免疫治疗的敏感性高

目的:探讨非A5.1型MHC-Ⅰ类相关分子A(MHC classⅠ-related molecules A,MICA)穿膜区等位基因对中晚期食管癌患者术后化疗联合NK细胞免疫治疗疗效的影响。方法:选取福建省肿瘤医院2013年4月至2015年10月收治的中晚期(TNMⅢ-Ⅳa期)食管癌患者152例,均在姑息性手术后行全身化疗,根据患者MICA穿膜区等位基因是否为A5.1分为4组:(1)A5.1化疗+NK细胞治疗(A5.1+NK)组;(2)A5.1单纯化疗(A5.1)组;(3)非A5.1化疗+NK细胞治疗(no A5.1+NK)组;(4)非A5.1单纯化疗(no A5.1)组,观察各组患者临床疗效。构建食管癌组织标本MICA等位基因A5.1的真核表达载体p TE-1A5.1,转染食管癌TE-1细胞株;Western blotting检测p TE-1A5.1转染对TE-1细胞MICA蛋白表达的影响,LDH法检测TE-1细胞转染p TE-1A5.1前后对NK细胞杀伤敏感性的变化,ELISA法检测食管癌患者血清可溶性MICA及转染p TE-1A5.1前后TE-1细胞上清中可溶性MICA含量。结果:经过3年的随防,A5.1+NK组患者中位总生存期(medium overall survival,m OS)为15.0个月,A5.1组为16.0个月,no A5.1+NK组为22.4个月,no A5.1组为16.0个月,no A5.1+NK组m OS明显长于其他3组(P<0.05)。经Cox多因素回归分析发现,患者年龄、性别、ECOG评分及基因型与预后均无明显相关(P>0.05),将基因类型与是否NK细胞治疗进行交叉分析,no A5.1+NK组m OS明显长于其他3组(P<0.01)。转染p TE-1A5.1后TE-1细胞内MICA表达显著升高,培养液上清可溶性MICA分泌明显增加[(256.2±45.3)vs(45.3±11.5)pg/ml,P<0.01];与转染前相比,NK细胞对过表达MICA的TE-1细胞的杀伤率明显降低[(29.5±7.2)%vs(42.5±7.1)%,P<0.05]。结论:相对中晚期食管癌MICA穿膜区A5.1等位基因患者,非A5.1基因患者手术后化疗联合NK细胞的疗效较好,其机制与其不容易产生可溶性MICA密切相关。

卵巢癌细胞MHC-Ⅰ类抗原表达与肿瘤微环境免疫细胞分布关系

目的 探讨卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达与肿瘤微环境免疫活性细胞分布的关系 ,了解机体肿瘤微环境免疫功能状态。方法 用流式细胞仪检测卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达 ,同时用免疫组化方法检测肿瘤微环境中LCA+ 、CD3 + 细胞分布情况。结果 卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达存在不同程度的下降或缺如 ,且与肿瘤微环境中LCA+ 、CD3 + 细胞分布呈正相关 ,前者r=0 .846 ,P =0 .0 0 0 1,后者r =0 .738,P =0 .0 0 0 1。结论 上皮性卵巢癌细胞MHC Ⅰ类抗原分子的表达影响肿瘤微环境中浸润免疫细胞数 ,进而影响肿瘤微环境免疫监视能力。检测MHC Ⅰ类分子表达可为肿瘤浸润淋巴细胞临床过继治疗选择合适病例提供实验依据。

沙眼衣原体感染对Hela细胞HLA-Ⅰ类分子表达的影响

目的 探讨沙眼衣原体 (Ct)感染对上皮细胞系Hela细胞HLA Ⅰ类分子表达的影响。方法 用直接免疫荧光和流式细胞仪分析等方法 ,对感染Ct的Hela细胞HLA Ⅰ类分子表达水平进行检测。结果 Ct感染的Hela细胞HLA Ⅰ类分子表达水平随感染剂量增加和感染时间延长而下降 ,并且IL 10抗体能部分抑制这种下降。结论 Ct感染可下调Hela细胞HLA Ⅰ类分子表达 ,下调与感染过程中分泌的IL 10有关 。

组织相容性Ⅰ类相关链A位点基因多态性在预判肾移植物排斥中的意义

目的研究组织相容性Ⅰ类相关链A位点（MICA）基因多态性和抗MICA特异性抗体在肾移植排斥反应发生中的意义。方法采用免疫磁珠液相芯片技术对40例肾移植患者在移植术前和移植术后1个月、3个月、6个月、1年和2年动态检测抗MICA抗体的特异性和阳性分值的变化,同时采用SSOP方法分析16对肾移植供受者的MICA基因分型,并把MICA基因具有相同抗原表位的特征性分为G1组和G2组。结果在40例肾移植中尸体供肾35例,亲缘活体供肾5例。35例肾移植受者均带肾存活良好,其中33例接受动态随访。移植术前预存抗MICA抗体为12例,其中抗MICA抗体10例、抗HLA-Ⅰ类＋MICA抗体2例;4例分为MICA-G1组、6例分为MICA-G2组、2例共为MICA-G1和G2组。16对供受者MICA等位基因频率分布：在MICA-G1组中频率M﹡002最高,M﹡007次之;MICA-G2组中频率M﹡008最高,M﹡009和M﹡019次之。33例移植术后有4例新生抗MICA抗体,3例新生抗HLA抗体,均为抗供者特异性抗体和抗非供者特异性抗体。移植术前预存抗MICA抗体,在移植术后1～2年的动态随访中其特异性均未改变,而抗体的阳性分值呈现高低的变化。12例移植术前预存抗MICA抗体中的3例和抗体阴性1例移植术后发生急性排斥反应,临床表现为发热,尿量减少,肌酐和肾动脉阻力指数升高。33例动态随访资料显示：无论是MICA基因频率分布特点,还是抗MICA特异性抗体类型与排斥反应的关系,M﹡002、M﹡004、M﹡008、M﹡019和M﹡001基因型最常见,但未见MICA﹡012和MICA﹡006基因型。结论移植术前分析供受者的MICA基因多态性,受者的特异性抗体鉴定和特征性分组;移植术后动态监测抗MICA抗体的变化,是肾移植术后预防急性和慢性移植物排斥的重要靶分子。

MHC Ⅰ类分子胞内组装、转运及其调控机制的研究进展

MHC Ⅰ类分子是启动机体免疫应答的重要分子。当细胞遭受病毒感染或本身发生癌变,MHCⅠ类分子能结合病毒或癌变细胞蛋白降解形成的多肽,向CD8+T细胞报告病毒或者肿瘤的存在,从而促使其对异常细胞的杀伤。在此过程中,MHCⅠ类分子的胞内转运途径精密调控着免疫应答的效率,但目前对MHCⅠ类分子在胞内转运途径的机制了解不多。本综述就MHCⅠ类分子在内质网的组装、外运以及内吞后降解或再循环过程中的主要机制做一阐述,并且介绍一些新发现的相关调控分子。

低表达MICA/MICB导致NK细胞对人鼻咽癌多药耐药细胞(CNE2/DDP)杀伤活性下降

目的探讨HLAⅠ类分子及MHCⅠ类链相关分子(MICA/MICB)在人鼻咽癌细胞株CNE2及多药耐药细胞株CNE2/DDP的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响。方法流式细胞仪检测CNE2和CNE2/DDP细胞表面HLAⅠ类分子和MICA/MICB的表达情况;LDH释放法测定3例健康者的NK细胞在不同效靶比时对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性;效靶比10∶1时,用抗HLAⅠ类分子单抗(W6/32)和抗MICA/MICB单抗(BAMO-1)分别封闭HLAⅠ类分子和MICA/MICB,观察NK细胞杀伤CNE2、CNE2/DDP细胞活性的变化。结果CNE2/DDP细胞表面HLAⅠ类分子和MICA/MICB的表达均较CNE2细胞明显减少(P<0.01)。NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性在效靶比5∶1时分别是(9.37±2.14)%、(4.37±0·63)%;效靶比10∶1时分别是(27.14±1.82)%、(15.79±2.87)%;效靶比20∶1时分别是(36.40±4.28)%、(26.20±4·18)%;效靶比301时分别是(54.67±2.80)%、(40.29±2.73)%。各效靶比时NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性与HLAⅠ类分子和MICA/MICB相关,NK细胞对CNE2/DDP细胞的杀伤活性明显低于CNE2细胞(P<0.01)。效靶比10∶1时,W6/32明显增强NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性(P<0.01),BAMO-1明显抑制NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性(P<0.01)。结论HLAⅠ类分子和MICA/MICB在CNE2、CNE2/DDP的表达差异影响着NK细胞的杀伤活性,MICA/MICB在多药耐药肿瘤细胞的低表达导致耐药肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性下降。

癌胚抗原低亲和力表位改造中的分子对接

目的通过分子对接方法筛选表位改造后的高亲和力CTL表位。方法在图形工作站上,将癌胚抗原来源的低亲和力表位及其N末端第一位残基以酪氨酸替换后的突变体,分别与MHCⅠ类分子进行对接,对接所得最佳构象进行600ps分子动力学模拟修正。结果改造后的突变体与MHC分子间存在较强的氢键和疏水相互作用,组成肽结合槽口袋A的残基Tyr7、Tyr171和Tyr159与多肽N末端形成稳定的氢键作用网络,并且P1位酪氨酸上的苯环可与Trp167上的苯环发生ππ堆积作用。结论分子对接模型预测的肽MHC复合物作用模式,提示改造后的突变体与MHCⅠ类分子间具有更高的亲和力,与实验结果一致。

NK细胞免疫编辑后的人鼻咽癌细胞株CNE2 HLA I类分子和MICA/MICB的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

目的:探讨自然杀伤(NK)细胞与表达NKG2D配体的人鼻咽癌细胞株CNE2混合培养24h时CNE2细胞表面HLAI类分子及MHCI类链相关分子(MICA/MICB)的变化及编辑前、后的CNE2细胞对NK细胞杀伤敏感性的差异.方法:PCR-SSP法检测NK细胞KIR分型,流式细胞仪检测编辑前的CNE2细胞(单纯培养的CNE2细胞),编辑后的CNE2细胞(NK细胞与CNE2细胞10∶1混合培养24h)表面HLAI类分子及MHCI类链相关分子(MICA/MICB)的表达情况,LDH释放法测定3例健康者的NK细胞在不同效靶比时对编辑前、后的CNE2细胞的杀伤活性.结果:编辑前、后的CNE2细胞表面MICA/MICB的表达率分别为(88.67±2.81)%和(34.53±3.15)%,两者相比差异有统计学意义(P<0.01);编辑前、后的CNE2细胞表面HLAI类分子表达率分别为(99.77±0.12)%和(97.80±0.87)%,两者相比差异无统计学意义(P>0.05).NK细胞对编辑前、后的CNE2细胞的杀伤活性在效靶比10∶1时分别为(26.96±1.47)%和(6.60±0.86)%,两者相比差异有统计学意义(P<0.01);效靶比20∶1时分别为(35.74±3.59)%和(11.57±2.02)%,两者相比差异有统计学意义(P<0.01).结论:CNE2细胞与NK细胞持续性接触24h,CNE2细胞表面HLAI类分子表达无改变,MI-CA/MICB表达下调,导致编辑后的CNE2细胞激发NK细胞杀伤活性下降.本研究初步证明了NK细胞对编辑后的肿瘤细胞杀伤活性下降的分子基础,同时为我们如何提高NK细胞的杀伤活性提供了新的干预的靶点.

同种异体NK细胞对人脐静脉内皮细胞ECV304的杀伤活性差异及分子机制探讨

目的探讨供者KIR分子表达差异对NK细胞杀伤人脐血内皮细胞系ECV304活性的影响,并观察参与杀伤的活化信号通路。方法RT-PCR及流式细胞仪检测ECV304细胞NKG2D配体MICA/B、ULBP1-3表达,PCR-SSP法行HLA-A、B、Cw分型。自8例健康供者分离外周血NK细胞,流式细胞仪检测KIR2DL1的表达率,LDH释放法测定NK细胞在效靶比20∶1时对ECV304细胞的杀伤活性及anti-KIR2DL1mAb对NK细胞杀伤活性的影响。结果ECV30细胞在mRNA水平表达MICA/B、ULBP1-3,但在膜蛋白水平均不表达。HLA分型表明,ECV304表达KIR2DL1的配体,而不表达KIR2DL2/3、KIR3DL1的配体。8例健康供者NK细胞KIR2DL1表达率有较大差异,对ECV304细胞的杀伤活性也有不同,双变量相关分析示个体KIR2DL1表达率与NK细胞对ECV304的杀伤率存在负相关(rS=-0.994,P=0.000)。anti-KIR2DL1mAb明显增强NK细胞对ECV304的杀伤活性(t=-4.860,P=0.002)。结论NK细胞对ECV304细胞的杀伤分子机制主要为HLA-KIR信号系统错配,目前已知的NKG2D配体MICA/B、ULBP1-3并不参与,这有助于临床活体器官移植时在遗传指导下选择供体。

低亲和力CTL表位肽在治疗性肿瘤疫苗中应用的研究

因为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)在肿瘤控制中起着重要作用,所以基于CTL表位(epitope)的治疗性肿瘤多肽疫苗已经成为当前肿瘤综合生物治疗中一个倍受瞩目的策略。传统的免疫治疗策略通常选择与MHC-Ⅰ类分子具有高亲和力的CTL表位肽作为治疗工具,但部分高亲和力的CTL表位肽在体内往往有免疫耐受或者副反应。近来研究表明:低亲和力的CTL表位肽及其改构体能很好地克服这些问题。本文就低亲和力CTL表位肽及其改构体在肿瘤免疫治疗中的研究进展做一综述。

抗原处理相关转运体(TAP)的结构和功能研究进展

抗原处理相关转运体(TAP)属于ABC(ATP-binding cassette)转运体超家族的B亚家族,是由主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)上2个紧密连锁的基因TAP1和TAP2编码蛋白组成的异二聚体,位于内质网和顺式高尔基膜上,功能是将抗原肽从细胞质转运进入内质网池,组装到MHC I类分子上构成复合体。TAP蛋白的缺乏和突变会影响抗原肽的提呈,最终损害免疫应答功能。

恶性疟CTL表位重组疫苗的构建及在人类HLA-A2和HLA-B51细胞中的表达

CTL是红前期恶性疟免疫防护的关键环节。MHC分子多态性和严格的种属特异性是限制CTL恶性疟重组疫苗研制的重要因素。本文选用中国人群常见的HLAI类分子A-2．1和B51限制的恶性疟CTL抗原表位TR26和SH6，进行表位DNA序列合成并将其克隆于真核表达载体，构建单表位DNA重组疫苗。同时应用同尾酶克隆技术，将上述表位DNA序列串联构建成双表位DNA重组疫苗pcDNA3．1TS。将以上克隆在含相应HLA抗原分子的细胞株中进行表达。经细胞表面HLAⅠ类分子表达水平检测证实，两个单表位DNA疫苗编码的短肽在细胞内的表达，明显促进相应HLAⅠ类分子在细胞表面的表达，用流式细胞仪测定平均荧光强度可量化表达水平（P＜0．05）。串联双表位DNA疫苗编码的肽并不受其位置毗邻的影响，分别促进HLA-A0201和HLA-B51的表达（P＜0．05），提示各自在相应细胞株内被加工违呈，此项研究提示：该串联表位疫苗可能为两种MHC遗传背景的人群提供免疫防护。

固定矫治病人龈沟液及其sICAM-1含量的检测

目的通过对固定正畸病人不同矫治时期牙周临床指标、龈沟液(GCF)及GCF中可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)的含量进行测定,探讨固定矫治对牙周组织的影响。方法随机选择口腔正畸科门诊牙齿拥挤错病人31例(男12例,女19例,年龄12～17岁),分别于矫治开始前1周,矫治开始后1、4、8周,记录16、21、23、36、41、43牙的近中颊侧共186个位点牙周临床指标,滤取并称量GCF,ELASE法检测sICAM-1的含量。结果与矫治前1周相比,矫治中各项牙周临床指标和GCF、sICAM-1的含量均呈现不同程度的上升趋势,其中牙龈指数(GI)和探诊深度(PD)矫治开始后1、4、8周与矫治前比较差异均有显著性(t=7.21～8.05,P<0.01);GCF量矫治开始后1、4、8周与矫治前比较差异均有显著性(t=15.18～25.37,P<0.001);GCF中sICAM-1的含量矫治开始后4、8周与矫治前比较差异有显著性(t=5.54～14.93,P<0.001)。结论固定正畸对病人牙周组织的健康有一定的影响。

肿瘤的G-CSF基因治疗及肿瘤原位细胞生物学特性

目的：研究瘤体内注射脂质体包裹的Ｇ－ＣＳＦ基因的抗肿瘤作用及其可能机制。方法：将脂质体包裹的Ｇ－ＣＳＦ基因直接注射至小鼠结肠癌瘤体内，观察Ｇ－ＣＳＦ基因治疗的抗肿瘤效果及肿瘤细胞性状的变化。结果：瘤体内注射脂质体包裹的Ｇ－ＣＳＦ基因后，可明显抑制结肠癌小鼠肿瘤的生长，显著延长存活期；配合大剂量化疗后效果更显著，有３０％的小鼠存活９０ｄ以上。从瘤体内分离的肿瘤细胞，经Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ）抗性筛选后，产生抗Ｇ４１８的抗性克隆，并分泌人Ｇ－ＣＳＦ（ｈＧ－ＣＳＦ）；经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定显示，该肿瘤细胞可表达Ｇ－ＣＳＦｍＲＮＡ；肿瘤细胞表面表达ＩＣＡＭ－１分子、ＭＨＣⅠ类抗原（Ｈ－２Ｋｄ）均明显高于对照组。结论：瘤体内注射脂质体包裹的Ｇ－ＣＳＦ基因后，可在肿瘤原位将Ｇ－ＣＳＦ基因转染肿瘤细胞并有效表达，提高肿瘤细胞的免疫原性。

主要组织相容性复合体I类分子抗原肽

被主要组织相容性复合体(MHC)I类分子呈递在细胞表面的抗原肽大部分来源于细胞内新合成蛋白质的降解产物,抗原肽直接体现细胞内功能蛋白质的部分变化,蛋白酶体、氨肽酶和抗原转运体(TAP)参与调控抗原肽的生成。在MHC的组装、折叠过程中,抗原肽促进各亚基的结合和折叠进程;而在起始细胞的免疫应答过程中,抗原肽不仅诱导T细胞抗原受体的特异结合,更为重要的是延长MHC同T细胞抗原受体特异结合的作用时间。

蛋白酶体抑制剂Bortezomib对NK细胞杀伤肝癌细胞活性的影响

目的探讨小剂量蛋白酶体抑制剂Bortezom ib对肝癌细胞MHCⅠ类分子(M ICA)的表达及NK细胞杀伤活性的影响。方法应用流式细胞仪和半定量RT-PCR检测肝癌细胞经小剂量蛋白酶体抑制剂Bortezom ib处理后M ICA表达水平。应用细胞毒实验和胞内染色检测NK细胞功能。结果肝癌细胞株或新鲜肝癌细胞经小剂量蛋白酶体抑制剂Bortezom ib处理后M ICA表达增加,进而促进经NKG2D途径介导的NK细胞杀伤活性。结论联合小剂量蛋白酶体抑制剂Bortezom ib和NK细胞为基础的免疫治疗有助于提高原发性肝细胞癌的综合治疗效果。

黏膜相关恒定T细胞在感染性疾病中的研究进展

黏膜相关恒定T细胞(mucosal-associated invariant T cell,MAIT细胞)是一类进化保守的固有样T淋巴细胞,它可以通过主要组织相容性复合物相关蛋白1(major histocompatibility complex classⅠ-like molecule,MR1)识别微生物来源的维生素B代谢物,迅速产生大量促炎细胞因子和颗粒酶,发挥其独特的抗感染作用。本文对MAIT细胞的性质、在感染性疾病中的作用及其作用机制作一综述。