四种天麻基于SLAF测序的SNP标记开发与分析

为了分析天麻种质资源的遗传多样性及其进化关系,开发特异性SNP(Singlenucleotidepolymorphism)标记位点。实验通过对4种不同种或不同产地的同种天麻共28个样品进行SLAF测序,首次在天麻种质资源中得到SLAF标签并开发SNP标记,通过De nove测序技术,构建SLAF文库,利用GATK和SAMTOOLS技术开发SNP标记。共获得75.95 M高质量的reads数据,471001个SLAF标签,其中多态性SLAF标签19675个,并开发出60238个群体SNP。对SNP标记的分析的结果表明,作为主要栽培种的天麻(W)由于长时间的人工培育,也许使得其遗传进化体系与其他的天麻种质资源存在较大差异。另外,所有样品中SNP标记的杂合率普遍高于20%,突出了天麻这一物种广泛的杂合性。而且,利用简化基因组测序技术SLAF-seq可以高效地、低成本地开发出大量的可用于群体遗传结构分析的SNP标记。

基于简化基因组测序的越橘杂交后代鉴定

【目的】针对遗传群体测序数据开发一种杂交后代鉴定方法,以获得继承双亲基因的真杂种后代,为果树杂交育种、遗传分析及遗传图谱构建奠定基础。【方法】本研究以越橘正反交群体共计318个F1子代和2个亲本为试材,利用SLAF技术进行简化基因组测序并比对越橘参考基因组获得群体SNP数据,通过稀有等位变异分析和基于PCA、K-means聚类的遗传关系分析鉴定供试群体中的非杂交后代,结果利用双亲纯合显性SNP标记进行验证。【结果】SLAF简化测序共获得65.89 Gb数据,GC含量39.72%,平均Q30为95.04%,亲本和子代平均测序深度为12.86×和5.41×。参照四倍体越橘基因组信息,正、反交组合分别获得73543个和114851个SNP,利用次等位基因频率(MAF)>0.05的SNP数据集分别对正、反交群体进行PCA和K-means聚类分析,鉴定出4个离群个体;利用MAF<0.05的SNP数据集对正、反交群体进行个体稀有等位变异和个体特有的稀有等位变异数统计,共鉴定出10个离群个体(包含了MAF>0.05的SNP数据集鉴定的4个离群个体)。通过双亲纯合显性SNP标记进行验证,正、反交群体双亲纯合SNP位点分别占群体总SNP的34.56%和38.95%,除H194-123个体外,其余非杂交后代在验证结果中同为离群个体,即准确通过验证。【结论】对于有参考基因组物种的杂交群体,利用基于测序的SNP次等位基因频率(MAF)数据集,采用遗传关系和个体特有的稀有等位变异分析方法,从不同角度反映群体子代间的遗传关系以鉴别离群个体,是一种鉴定群体假杂交后代的有效方法。

基于高通量测序的青稞产量相关性状的基因定位及候选基因挖掘

青稞是青藏高原最具特色的农作物,主要分布在海拔3 000 m以上的高寒地带。为寻找控制青稞的抗倒、早熟以及穗部性状、株高、分蘖等产量相关性状的基因,采用简化基因组测序技术(specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF)对300份青稞自然群体进行全基因组测序,对抗倒相关性状和SNP标记检测结果利用MLM和GLM模型进行全基因组关联分析(GWAS),共挖掘到与抗倒性密切相关的分子靶点184个,并筛选出91个可能与青稞抗倒密切相关的基因。采用简化基因组测序技术(genotyping-by-sequencing,GBS)构建包含了3 662个SNP标记,7条染色体遗传图距为160.21～227.21 c M,所有连锁群的平均图距为0.57 c M。利用这一图谱定位了5个与紫粒相关的QTL,在区间内找到5个与花青素合成相关的结构基因和1个调控基因,并进行了功能验证。同时利用该遗传图谱在1H、2H和4H上定位了与早熟相关的QTL 4个;与产量相关的QTL共92个,其中在1H、3H、4H上定位到与株高相关QTL 5个;在2H上定位到与穗数相关QTL 2个;在4H、5H上定位到与穗长相关QTL 2个;在7H上定位到与穗粒数相关QTL 6个;在3H、5H、6H上定位到与穗粒质量相关QTL 9个。

玉米SLAF标记的开发及其在玉米果皮纤维素含量BSA分析中的应用

【目的】降低果皮纤维素是甜玉米品质改良的重要目标,然而玉米果皮纤维素含量调控的研究甚少,相关调控基因尚未定位。利用纤维素含量差异的重组自交系(RILs)群体,通过特异位点扩增片段(specific-locus amplified fragment-sequencing,SLAF)测序和分离混池分析(bulked segregant analysis,BSA)定位控制玉米果皮纤维素含量的染色体区段,鉴定调控玉米果皮纤维素含量的候选基因。【方法】以果皮纤维素含量显著差异的E327和G5-1为亲本,构建重组自交系(RILs)。对RILs群体进行果皮纤维素含量的测定,并根据纤维素含量的结果选择纤维素含量高、低的样本进行混池,用于SLAF标签的鉴定和BSA分析。在BSA分析中,首先对两混池和2个亲本DNA用HaeⅢ和Hpy166Ⅱ进行酶切,回收414—464 bp的酶切片段进行Illumina建库,并进行SLAF测序,然后根据多态性SLAF标签开发SNP标记,利用SNP标记对玉米果皮纤维素含量进行关联分析,鉴定调控甜玉米果皮纤维素含量的染色体区段。分析这些区段所包含的玉米基因,并找到它们对应的拟南芥同源基因,通过查阅拟南芥相关基因功能研究的文献,进一步鉴定控制玉米果皮纤维素含量的候选基因。【结果】两亲本和2个混池SLAF建库测序得到的SLAF符合预期,基于SLAF测序数据,鉴定了73 786个多态性SLAF标签,这些SLAF标签均匀分布在玉米的10条染色体上。在这些多态性标签中得到了523 395 SNP位点信息。通过关联分析,调控果皮纤维素变异的基因被定位到玉米基因组的6个染色区段,都位于玉米的第5染色体上。在这些区段上,一共有47个玉米基因。通过进一步的研究分析,在这些关联的染色体区段最终确定了9个候选基因。【结论】定位到调控玉米果皮纤维素的含量的基因,表明此方法可以用于基因定位。

甜瓜SLAF图谱构建及果实相关性状QTL分析

【目的】通过对甜瓜果实相关性状进行QTL定位及候选基因分析,为甜瓜品质育种及基因挖掘与功能验证提供理论基础。【方法】利用薄皮甜瓜1244为母本、厚皮甜瓜M5为父本配置杂交组合,结合SFLA测序技术开发分子标签,构建高密度遗传图谱,以F2:3表型数据为基础,采用Mapqtl进行QTL定位分析。【结果】获得了380446 Mreads(83.12 Gb)数据,测序平均Q30为93.59%,平均GC含量为36.87%;开发了112844个SLAF标签,3274879个SNP;构建了12个连锁群,共计10596个上图标记,总图距为1383.88 cM,标记间平均距离为0.13 cM,上图标记完整度平均为99.92%。将控制甜瓜果面沟性状基因(fst)定位在第11条染色体末端Marker 1993423(62.18)—Marker 1998820(63.05),覆盖基因组0.72 Mb,包含33个候选基因;控制甜瓜果皮花纹基因(fpp)定位在第2条染色体Marker 459584(90.91)—Marker 459446(90.91),覆盖基因组0.08 Mb,包含5个候选基因,其中MELO3C026292(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)可能为控制果皮花纹的候选基因;同时检测到甜瓜果皮底色1个QTL位点fpc,位于第7条染色体Marker 1229174(7.14)—Marker 1229973(7.14),贡献率为9.9%;检测到果型指数1个QTL位点fs9.1,位于第9条染色体Marker 1705671(76.19)—Marker 1705915(79.23),贡献率为7.6%;在第1、2、6、7、10染色体检测到单果重相关6个QTL位点(sfw1.1、sfw2.1、sfw2.2、sfw6.1、sfw7.1、sfw10.1),贡献率在3.1%—17.0%,LOD值介于3.0—5.6。【结论】将甜瓜果面沟、果皮花纹基因分别定位在第11和第2条染色体,分别获得33个和5个候选基因;检测到1个果皮底色QTL位点、1个果型指数QTL位点和6个单果重QTL位点。

中国野莲居群遗传多样性及群体结构分析

以我国长江中下游地区和北方地区33个居群的195份野莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)为材料,基于SLAF简化基因组测序技术,对不同区域野莲居群的遗传多样性进行研究。结果显示:通过测序共得到742992个SLAF标签,挖掘高质量SNP位点1064789个;供试材料基因型差异明显,主要可分为长江流域和东北区域2个亚群。研究结果支持长江流域野莲和东北区域野莲应分属为亚热带及温带生态型莲。我国野莲居群总多样性较低(π=1.04×10^(-5)),居群间平均分化系数较高(F_(ST)=0.42)。长江中下游地区不同湖泊野莲π值变幅为0.5×10^(-5)~2.2×10^(-5),梁子湖野莲多样性最为丰富。梁子湖区域内各个小湖π值为3.13×10^(-6)~2.3×10^(-5),表明小湖内不同居群仍存有较大遗传差异。北部地区不同湖泊野莲π值变幅为3.05×10^(-6)~1.50×10^(-5),山东梁山古代莲多样性最为丰富。长江中下游地区野莲遗传多样性高于北部地区且两者间分化程度较高(F_(ST)=0.34),表明野莲居群间和区域间均有较高的分化程度,原因可能是野莲居群内主要为克隆繁殖,而居群间基因交流少所致。

番茄抗叶霉病基因Cf-12定位及候选基因分析

近年来,番茄叶霉病的大面积发生对中国番茄生产造成极大影响。叶霉病菌(Cladosporium fulvum)与番茄植株发生的亲和性互作是番茄叶霉病发生的根源,以叶霉病抗性基因Cf为主导的抗叶霉病育种研究是工作的重点,但由于Cf基因抗性不断被克服,急需挖掘抗性更广更强的Cf基因。番茄品种‘CGN7495’含有Cf-12基因,田间表现出有效的C.fulvum抗性。本研究通过构建6世代群体,分析了Cf-12抗性的遗传规律,证实了该基因符合单基因的显性遗传规律,为分离群体分组分析法筛选Cf-12基因做了铺垫;采用父母本重测序及F2代极端性状混池简化测序SLAF(Specific locus amplified fragment sequencing)来定位Cf-12基因,将其定位到番茄第6号染色体上并最终筛选出3个候选基因。研究为Cf-12的精确克隆和相关抗病机制的研究提供了理论参考。