基于SLAF-seq技术开发长穗偃麦草染色体特异分子标记

长穗偃麦草1E及7E染色体上带有重要的抗赤霉病基因,开发大量相关染色体特异分子标记有助于准确定位抗性基因及获得可用于辅助育种紧密连锁的标记。基于SLAF-seq技术,获得了368个长穗偃麦草1E染色体特异片段,随机选取80个特异片段设计引物,开发了20个长穗偃麦草1E染色体特异分子标记、2个长穗偃麦草基因组特异分子标记及26个其他特异分子标记,效率达60%。用这些特异标记能稳定检测出不同小麦-长穗偃麦草衍生材料中的1E染色体或片段。通过标记与优良性状的共分离特性,获得与相关基因紧密连锁的标记,将为小麦抗性育种中的分子标记辅助选择提供依据。

基于SLAF-seq技术构建亚麻高密度遗传图谱

为大量开发SNP用于构建亚麻高质量的连锁遗传图谱,以亚麻品系R43为母本,LH-89为父本,通过杂交构建F2群体,采用SLAF-seq技术,对两个亲本和F2群体100个个体进行高通量测序、SNP标记的开发及亚麻高密度遗传图谱的构建。对参考基因组进行电子酶切预测,最终确定使用HaeⅢ和RsaⅠ酶,酶切片段大小在314~414bp的序列定义为SLAF标签。其次,对基因组DNA进行酶切和SLAF文库构建。最后通过高通量测序获得测序数据,进行多态性SLAF的鉴定和SNP标记的发掘,采用High Map软件构建亚麻高密度遗传图谱。通过高通量测序,共获得196.29M reads,平均质量Q30为81.95%,平均GC含量为38.64%。通过生物信息学分析,共获得260 380个SNP标记,其中有4 547个SNP为高质量SNP标签,用于标记的定位和图谱的构建。共构建15个连锁群,总图距为2 632.94c M,标记间的平均距离为0.92c M。这是在亚麻中首次应用SNP标记构建的高密度遗传图谱,为亚麻的遗传研究和分子标记辅助育种奠定了基础。

基于SLAF-seq技术的乔木柳SNP位点开发

【研究意义】采用SLAF-seq测序技术开发乔木柳SNP位点对乔木柳育种发展有重大意义。【方法】本研究根据两亲本和杂交的F1代遗传群体经亲本鉴定195株为研究对象,利用SLAF-seq测序技术进行测序。选择同科基因组大小相似的三角叶杨的基因组作为参考基因组,通过电子酶切预测,最终选择Hae III和Hpy166 II两种酶进行酶切试验,长度在314~364 bp之间的酶切片段序列定义为SLAF标签,预测可得SLAF标签126 008个,位于重复序列区的SLAF标签比例为1.60%。为进一步评估酶切方案的有效性与酶切效率,以水稻的测序数据为对照,通过SOAP软件比对水稻基因组(大小为382M)的测序reads与三角叶杨的基因组。【结果】通过研究得到双端比对效率为96.67%,酶切效率为92.06%,SLAF建库正常。采用本次研究中开发得到的SLAF标签277 333个,按照等位基因数和基因序列之间的差异,共获得99 526个多态性SLAF标签,比例达到35.89%。按照遗传学通用等位编码规则,成功编码了58 763个多态性SLAF标签。为构建遗传图谱进一步对SLAF标签进行过滤,最终获得6744个SLAF标签,进一步进行SNP位点的开发,在各连锁群上共开发得到9488个SNP位点。【结论】SLAF-seq技术可以很好地应用于乔木柳SNP位点的开发,可利用所开发的SNP标记,联系群体中不同个体的表型,关联定位与某性状紧密连锁的分子标记,进而可以实现优良基因的精细定位。

基于SLAF-seq技术的黑棘鲷微卫星标记开发及其在鲷科鱼类中的通用性研究

黑棘鲷(Acanthopagrusschlegelii)是广泛分布于西北太平洋的暖温性中下层经济鱼类,也是我国沿海重要的海洋捕捞鱼类和增养殖对象。然而,目前有关黑棘鲷的微卫星标记研究报道较少,难以对其种质资源状况作出精确评估。本研究采用SLAF-seq技术测序共获得22489个二至六碱基重复的黑棘鲷微卫星序列,短重复序列(二、三碱基)占总微卫星序列的90.8%,长重复序列(四至六碱基)占有9.2%。经过157对随机合成引物的多态性筛选,开发出49个高多态性的黑棘鲷微卫星标记,其中短重复序列位点有25个,长重复序列位点有24个。每个位点的等位基因数(Na)为2—20(均值为8.3),观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.097—0.938和0.122—0.922(均值分别为0.663和0.701),多态信息含量(PIC)为0.118—0.897(均值为0.655)。经Bonferroni校正后,有47个位点符合哈迪-温伯格平衡(HWE),各位点间未检测到连锁不平衡现象,仅2个位点偏离HWE。结果表明,所开发的大部分微卫星标记具有高多态性,蕴含的遗传信息含量较为丰富,能够为黑棘鲷的种群遗传资源评估提供数量充足、类型多样的有效分子标记。跨物种扩增结果显示,有43个黑棘鲷微卫星标记可在9种鲷科鱼类中成功扩增,其中28个标记在太平洋棘鲷(Acanthopagruspacificus)、黄鳍棘鲷(Acanthopagruslatus)和澳洲棘鲷(Acanthopagrusaustralis)中具有较好的通用性,2个标记在平鲷(Rhabdosargussarba)、蓝点赤鲷(Pagruscaeruleostictus)、真赤鲷(Pagrusmajor)、二长棘犁齿鲷(Evynnis cardinalis)及黄牙鲷(Dentex hypselosomus)中具有通用性。这些通用性标记可为阐明鲷科属、种间的系统进化关系和棘鲷属鱼类的群体遗传学分析提供新的标记来源和研究角度。

基于SLAF-seq技术的不同类型越橘遗传变异和群体结构研究

【目的】利用越橘属栽培品种及野生资源在全基因组范围内筛选差异SNP分子标记,分析其遗传变异,了解不同类型群体间的遗传变异、基因交流、群体结构,为越橘种质创新提供遗传背景依据。【方法】以越橘属9个种的62份种质资源为材料,利用特异性位点扩增片段测序技术(SLAF-seq)获得的基因组SNP标记比对到品种Draper参考基因组上,进行供试材料遗传研究。【结果】测序获得169.87 Mb reads数据,平均Q_(30)值94.99%,包含172 513个多态性SLAF标签,筛选到高质量SNP标记4 133 595个,均匀分布在越橘12条染色体上。基于SNP标记的系统进化树准确反映了供试野生、北高丛和南高丛类群遗传差异以及品种间系谱遗传关系,反映出野生类型与栽培品种遗传差异显著,供试野生种具有独立的遗传背景且种间无基因交流发生,但野生种到栽培种存在单向的基因流;栽培品种类群存在明显的亚群结构,亚群间存在普遍的基因交流;半高丛品种北陆和南高丛品种军号与北高丛类型紧密聚类,矮丛品种美登、半高丛品种北村、黑珍珠遗传背景倾向于野生种。【结论】栽培品种近亲杂交和骨干亲本高频率使用导致品种间基因交流频繁、同质性高、遗传基础狭窄,野生种具有独立的遗传背景,但存在野生种到栽培种的单向基因流,应加大野生资源发掘利用以拓宽越橘遗传基础。

基于SLAF-seq技术的苹果SNP位点开发及遗传多样性分析

为了解黑龙江苹果种质资源的遗传关系,利用特异性位点扩增片段测序技术(SLAF-seq)对在黑龙江地区收集的31份苹果种质资源进行SNP位点开发和遗传多样性分析。最终获得了107.52 Mb读长数据,不同材料的SNP标记数目在309 012~540 030间,样品测序质量值平均Q30为93.78%,平均GC含量为40.90%。共开发获得1 072 115个SLAF标签,其中,多态性SLAF标签有275 389个。通过序列分析,共得群体SNP位点121 352个,基于开发SNP分子标记,结果表明,31份苹果种质资源分为3个亚群,特异性的苹果SNP位点开发和研究可为苹果种质资源鉴定和遗传多样性分析提供理论基础。

基于SLAF-seq技术的甘薯SNP位点开发

【目的】单核苷酸多态性(SNP)是基因组中最普遍的遗传变异,是构建遗传图谱、完成分子标记辅助育种的一种非常重要的遗传标记。新一代高通量测序平台为SNP位点的检测提供了强有力的技术支持。多倍体作物通常表现为基因组序列大且重复比例高,一直以来多倍体作物的SNP位点挖掘面临巨大的挑战。【方法】共收集300份甘薯种质资源,利用SLAF-seq测序技术进行测序。首先以马铃薯基因组为参照,通过生物信息学分析进行实验方案的系统设计,筛选特异长度的DNA片断,构建SLAF-seq文库。后通过高通量测序的方式获得海量序列,进而通过软件分析比对,获得多态性SLAF标签,最后在多态性SLAF标签上开发大量特异性SNP位点。【结果】对照拟南芥的测序数据与其参考基因组进行比对的结果表明,双端比对效率在本试验中为87.71%,酶切效率为93.22%,说明本试验SLAF建库正常。通过测序共产生498.14 Mb的读长数据,测序后各样品所获得的读长数目在441 595—2 731 920范围内,其中,冀薯4号获得的数据量最大,共计获得2 731 920个读长,对照拟南芥数据量最小,共计获得441 595个读长。测序质量值Q30的范围在88.37%—90.67%,样品3043 Q30测序值仅为87.31%,样品鄂紫1号Q30测序值为91.31%,所有样品Q30值均在80%以上。测序获得GC含量的范围在37.23%—38.09%,样品苏薯9号和浙薯2号存在极端值,样品苏薯9号的GC含量在39.80%,样品浙薯2号GC含量在37.10%,所有样品GC含量均值为37.64%,GC含量普遍不高,说明达到测序要求。本研究共计获得597 094个SLAF标签,样品的平均测序深度为11.77×,其中多态性SLAF标签260 000个,占SLAF标签总数的43.54%。根据所获得的260 000个多态性SLAF标签来统计SNP位点信息,共计获得795 794个群体SNP位点。【结论】共获得498.14Mb的读长数据,597 094个高质量的SLAF标签,260 000个多态性SLAF标签,从260 000个多态性SLAF标签上共计开发获得795 794个高质量SNP位点。表明SLAF-seq技术可以很好地应用于甘薯SNP位点的开发,其效率远远高于SSR、AFLP、RAPD等分子标记技术。从全基因组范围获得的SNP位点可以进一步的用来完成后续群体进化分析和特异性SNP标记的开发。

基于SLAF-seq技术的金花茶SNP标记开发及遗传分析

为了解金花茶种质的遗传关系,利用SLAF-seq测序技术对在不同地区收集的25份金花茶种质与山茶科其他5份种质进行测序。以猕猴桃基因组为参照,对金花茶基因组DNA酶切构建SLAF-seq文库,利用SLAFseq测序技术对其进行高通量测序、SNP标记开发及其进化关系分析,在多态性SLAF标签上开发特异性SNP位点,最后根据SNP位点构建25份金花茶种质与山茶科其他5份种质的进化树。最终共开发1471113个SLAF标签,其中多态性SLAF标签有69597个;共得到443819个群体SNP位点,其中高一致性的群体SNP位点119452个。遗传分析结果表明,金花茶种群的遗传多样性水平较高,可分成2个大的类群,其中第2类群包含了全部收集的金花茶种质,其又可分为3个亚族,这3个亚族的分化有明显的地域特征。第1亚族主要是来源于越南的金花茶品系,第2亚族由2个越南的金花茶品系和5个中国的金花茶品系组成,第3亚族全部由来源于中国的金花茶品系组成。研究结果从基因组水平揭示不同地区金花茶种质之间的遗传关系,所开发的SNP位点可进一步用于金花茶种群的进化分析、重要性状的关联分析等。

基于SLAF-seq技术的甘薯种质资源群体遗传进化分析

基于简化基因组测序技术对122份甘薯种质资源进行分析,开发SNP位点并将其应用于种质资源群体结构和遗传进化分析。结果表明,从122份甘薯种质资源中共获得563.18 Mb读长,不同材料的读长数量在1 419 809~8 392 785范围之间。测序质量值Q30在90.61%~96.82%之间,平均Q30为92.78%。测序获得的GC含量在36.46%~40.33%之间,平均GC含量为38.17%,对照GC含量为40.72%。根据测序结果共开发出高质量的SLAF标签2388759个,平均测序深度为17.45’。其中,多态性的SLAF标签77761个,占SLAF标签总数的3.26%。根据所获得多态性SLAF标签统计SNP位点信息,共计获得129 063个群体SNP位点。遗传进化分析表明122份种质资源可以分为3个大类,分类结果与它们的地理来源无直接关系,聚类结果可为甘薯育种亲本组配和杂种优势利用提供科学依据。

基于SLAF-seq技术鉴定甘蓝型油菜叶缘裂刻性状候选基因

叶缘裂刻性状是甘蓝型油菜遗传育种的理想形态标记。叶缘裂刻性状变异材料的创建对丰富甘蓝型油菜叶片形态和优良品种改良至关重要。本研究以甘蓝型油菜常规品种中双11和甘蓝型油菜叶缘裂刻新品系Y176为亲本(通过甘蓝型油菜与菜远缘杂交获得),从F2群体中分别挑选出叶缘裂刻和正常叶形的植株各50株,构建了两个极端性状混池DNA文库,借助SLAF-seq-BSA技术,挖掘甘蓝型油菜叶缘裂刻性状相关候选基因。共开发出177941个SLAF标签,通过分析SLAF标签的多态性,共获得150168个SNP,其中亲本间共获得128200个SNP。对ED方法和SNP-index方法得到的关联区域进行综合分析,获得1个与目标性状紧密关联的候选区域,位于甘蓝型油菜A10染色体上的14528149～17353693区域,总长度为2.83 Mb,约有666个编码基因。与前人研究定位在同一染色体上,但本研究定位的区间与前人研究不同,说明本研究存在控制叶缘裂刻新基因的可能性大。并对该区域内基因进行功能注释,其中666个注释到NR数据库;517个注释到SwissProt数据库;587个注释到GO数据库;151个注释到KEGG通路;258个注释到COG数据库,对候选基因进行注释有助于进一步分离相关基因。

基于SLAF-seq技术的山西省地方梨品种的SNP分析

利用简化基因组测序技术SLAF-seq测序对30个山西省地方梨品种群体结构与亲缘关系进行分析,旨在为梨育种及其资源利用提供参考。通过序列分析,获得603177个SLAF标签,其中多态性的SLAF标签302703个,共得到2140079个群体SNP。利用这些SNP标签分析可得30个梨品种可以分为两大类。通过构建进化树发现,‘金梨’与‘大黄梨’虽田间性状比较相似,但在进化树上显示两者亲缘关系较远,可以断定二者为不同梨品种。

基于SLAF-seq技术的红心火龙果SNP位点开发及遗传分析

为分析不同品种红心火龙果的遗传关系,本研究采集国内14种红心火龙果品种,通过生物信息学分析进行实验方案的系统设计,将所提取基因组进行酶切,筛选特异长度的DNA片断,构建SLAF-seq文库后进行高通量测序,将获得的序列进行分析比较后得到多态SLAF标签,在此标签基础上进一步开发特异性SNP位点,最后建立14种红心火龙果品种的进化树。本研究共开发159 560个SLAF标签,样品的平均测序深度为5.26×;共得到120 294个群体SNP,其中高一致性的群体SNP 51 859个。12种红心火龙果聚类结果发现,样品1、2、6、8、10同缘关系相近;样品3、5、7、9同缘关系相近;样品4、14同缘关系相对较近。研究表明应用SLAF-seq技术开发分子标记的效率比ISSR、RAPD、AFLP等常规技术更高。12种红心火龙果的聚类结果从基因组水平揭示不同地区品种之间的遗传分化关系,为火龙果种质的保护和遗传改良提供参考。

基于SLAF-seq技术的古茶树SNP位点开发

为给古茶树遗传图谱构建、分子辅助育种和物种进化等研究提供参考,以48份贵州古茶树种质为研究对象,利用SLAF-seq技术,获取大量多态性SLAF标签,进而开发一批特异性强、稳定性高的单核苷酸多态性(SNP)位点。结果表明,利用猕猴桃参考基因组进行电子酶切预测,选择HaeIII酶进行酶切,得到237773个SLAF标签,其双端比对效率为91.40%,酶切效率为96.41%,说明SLAF建库正常。测序后各样品所获得的读长数为1279534~8460233,测序质量值Q30范围为92.61%~94.88%,均值为93.84%,测序获得的GC比例为43.52%~47.18%。共开发1656258个古茶树SLAF标签,样品的平均测序深度为24.21×,其中多态性SLAF标签有462897个,根据所获得的多态性SLAF标签来统计SNP位点信息,共得到2690638个群体SNP标记,根据完整度大于0.8且次要基因频率(MAF)大于0.05的标准进行过滤,得到283376个高一致性的群体SNP标记。

基于SLAF-seq技术构建栽培草莓高密度遗传图谱

为大量开发SNP用于构建栽培草莓高质量的遗传图谱,以国产草莓品种红星为母本,日本草莓品种红颜为父本构建F1群体,采用SLAF-seq技术和HighMap软件,对2个亲本和200个F1子代群体进行高通量测序、SNP标记的开发及高密度遗传图谱的构建。通过高通量测序,共获得565919066 reads,平均质量Q30为95.36%,平均GC含量为39.68%,样本GC分布正常。通过生物信息学分析,共获得717881个SLAF标签,2136939个SNP标记,其中有56237个SNP为高质量标记可用于遗传图谱标记的定位和构建。共构建了28个连锁群,总图距为4022.16 cM,该图SNP标记14412个,完整度为99.84%,标记间的平均距离为0.28 cM。通过对遗传图谱单体来源进行评估,结果表明每个个体中较大区段均来源于亲本;通过连锁关系热图对相邻标记间的连锁关系进行分析,结果表明,每个连锁群上的大部分标记顺序与基因组保持一致,标记顺序正确,图谱质量高。这是栽培草莓中首次采用SLAF-seq技术构建的高密度SNP遗传图谱,为栽培草莓的遗传研究和分子标记辅助育种奠定了基础。

基于SLAF-seq技术的油茶SNP位点开发及杂交后代早期鉴定

为了开发大量的分子标记用于油茶(Camellia oleifera)亲本杂交后代的早期鉴定,本研究采用SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)技术对9个油茶样品(包括5个亲本及其4个子代单株)进行测序并开发SNP标记。最终根据多态性SLAF标签,开发得到1 644 616个群体SNP。基于群体SNP的亲子关系分析结果表明,岑软(Cenxi soft-branch C.oleifera)ZJ11为岑软2号与岑软11号的杂交后代,岑软ZJ14为岑软11号与岑软22号的杂交后代,岑软ZJ24为岑软11号与岑软24号的杂交后代,优31则是岑软11号与岑软23号的杂交后代。

SLAF-seq技术在鉴别桉树品种中的应用

本文尝试采用一种简化基因组测序技术(SLAF-seq)对2个尾巨桉无性系品种进行分子鉴定。实验共获得32.69 M reads的测序数据,测序质量值分布检查结果 Q30为95.28%,碱基分布检查结果 GC含量为40.61%;通过生物信息学分析共开发SLAF标签857589个。样品间SNP多态性比较结果表明,A1与A2、A3的基因型一致SNP比例分别为35.81%、77.27%,达到区分不同无性系品种的实验设计预期。

基于SLAF-seq技术的树莓SNP位点开发

为分析树莓群体的遗传进化关系,开发特异性SNP标记。选用23个栽培种树莓以用SLAF-seq技术测序,从树莓全基因组范围开发SNP位点,以黑树莓基因组为参考基因组,通过生物信息学分析进行电子酶切预测,筛选特异长度的DNA片断,构建SLAF-seq文库。通过高通量测序的方式获得海量序列标签,利用软件分析比对,获得多态性SLAF标签,进而开发大量特异性SNP位点。对照水稻的测序数据与参考基因组比对结果,双端比对效率为95.60%,酶切效率为93.52%,说明SLAF建库正常。通过测序共产生59.93 Mb的读长数据,测序质量值Q30平均为95.07%,所有样品GC含量均值为39.16%,GC含量普遍不高,说明达到测序要求。本研究共获得425402个SLAF标签,其中多态性的SLAF标签共有121610个。获得749811个有效单核苷酸多态(SNP),利用这些SNP分析了23个树莓种质的群体结构与系统发生树。利用简化基因组测序技术SLAF-seq可以高效地、低成本地开发出大量的可用于群体遗传结构分析的SNP标记。

基于SLAF-seq技术的白皮松SNP分子标记开发

【目的】在白皮松全基因组范围内开发大量特异性SNP分子标记,为白皮松关键基因定位、分子标记辅助选择和种质资源评价提供足够多的分子标记资源。【方法】本研究以5个群体的共52份白皮松资源为材料,选择火炬松基因组为参考基因组,利用特异性位点扩增片段测序技术(SLAF-seq),在多态性SLAF标签上开发大量特异性SNP位点,并过滤出一批高质量SNP位点用于白皮松不同群体的遗传多样性分析。【结果】通过序列对比分析,共获得23597049个SLAF标签,其中具多态性的SLAF标签有370659个,共开发得到1291290个白皮松群体SNP。在缺失率小于20%、次要等位基因频率(MAF)大于5%的条件下,对所有SNP位点进行过滤,共得到346840个高一致性的白皮松群体SNP,占SNP总量的26.9%,其中包含9个仅在北京鹫峰(JF)群体中存在变异的SNP位点、148个仅在陕西蓝田(LT)群体中存在变异的SNP位点、425个仅在甘肃麦积山(MJS)群体中存在变异的SNP位点、1466个仅在陕西午子山(WZS)群体中存在变异的SNP位点、4个仅在山西柏洼山(BWS)群体中存在变异的SNP位点。基于过滤后的346840个SNP分子标记在5个白皮松群体中进行的遗传多样性分析表明,白皮松不同群体间的遗传多样性存在显著差异,其中MJS和WZS群体的遗传多样性水平相对较高,JF群体的遗传多样性水平相对较低。【结论】研究结果表明,利用SLAF-seq技术可以实现全基因组范围内大量SNP标记位点的开发,且开发的SNP标记在白皮松不同群体中表现出较为丰富的遗传多态性,为白皮松种质资源鉴定、QTL定位、遗传连锁图谱构建以及重要性状的关联分析等研究奠定了基础,对今后白皮松种质资源保护和分子标记辅助选择育种具有重要意义。

基于SLAF-seq技术的苦瓜白粉病SNP分子标记开发

以高抗白粉病苦瓜MC18和高感白粉病MC105杂交构建遗传分离群体,利用SLAF-seq技术进行深度测序,开发与抗白粉病性状紧密关联的SNP分子标记。结果表明:测序共获得各样品的有效reads为10.48 Mb,获得高质量的SLAF标签91 856个,其中多态性SLAF标签5 502个,多态性比例为5.99%。通过对多态性SLAF标签进行关联分析,筛选出与苦瓜白粉病抗病性状紧密关联的SNP位点共29个。根据关联分析结果 ,通过四引物扩增受阻突变体系PCR技术进行SNP位点多态性的验证,其中Marker4542、Marker11188分子标记特异性强、灵敏度高、稳定性好,建立一套简便快捷的苦瓜SNP分型方法。该方法可对苦瓜育种材料进行分子标记辅助选择,以进一步提高苦瓜抗病育种效率。

利用SLAF-seq技术开发新寡核苷酸探针鉴定小麦背景中的黑麦染色体

【目的】通过荧光原位杂交(FISH)技术能有效地检测小麦背景中的黑麦染色体,进一步发现利用寡核苷酸探针和非变性FISH(ND-FISH)技术可以提高黑麦染色体的检测效率。【方法】通过借助SLAF-seq(specific length amplified fragment sequencing)和生物信息学方法开发寡核苷酸探针。【结果】开发了3种新的寡核苷酸探针Oligo-2874、Oligo-5296和Oligo-9965,它们可用于ND-FISH分析。通过与小麦背景中的黑麦染色体端部和亚端部特异杂交,从而达到识别黑麦染色体的目的。【结论】这些寡核苷酸探针可以用于快速高效地鉴定小麦背景中的黑麦染色体,丰富了小麦-黑麦杂交后代FISH分析的探针源。研究结果也表明SLAF-seq技术可以用来开发小麦近缘种属特异的重复序列FISH分析探针。