乳腺癌中印记基因SLC22A18／TSSC5／BWR1A启动子区甲基化及mRNA表达的研究

目的:研究印记基因SLC22A18启动子区甲基化对乳腺侵润性导管癌组织中的SLC22A18mRNA表达的影响,探讨其与临床病理特征之间的关系。方法:实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitativeRT-PCR)方法检测40例乳腺侵润性导管癌及其癌旁组织中SLC22A18mRNA的表达,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测SLC22A18基因启动子区的甲基化状态。检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine,5-aza-dc)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-231后,对SLC22A18基因启动子区DNA甲基化和mRNA表达的影响。结果:SLC22A18在40例乳腺侵润性导管癌中mRNA表达量低于癌旁组织(0.12±0.10vs0.69±1.05,P<0.01);40例乳腺侵润性导管癌及对应癌旁组织中,SLC22A18启动子区的甲基化发生率分别为75%和37.5%,差异有统计学意义(P<0.01);在40例乳腺侵润性导管癌组织中,甲基化组SLC22A18mRNA表达量低于非甲基化组(0.11±0.08vs0.24±0.18,P<0.01)。5-aza-dc和5-aza-dc/TSA能不同程度逆转乳腺癌细胞株MDA-MB-231中SLC22A18基因的甲基化状态,并上调SLC22A18基因表达。结论:SLC22A18基因甲基化与乳腺癌发生有一定的关联,SLC22A18基因表达下调与其启动子区CpG岛异常甲基化相关。

非小细胞肺癌中SLC22A18的表达及其临床意义

背景与目的已有的研究证明:多药耐药(multidrug resistance,MDR)是肺癌化疗失败的主要原因,研究MDR的产生机制对于提高肺癌的化疗疗效有着重要的临床意义。SLC22A18基因编码蛋白与跨膜转运体相似,影响药物敏感性、细胞代谢和生长,可能在肺癌MDR的产生中发挥一定作用。本研究旨在检测SLC22A18在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)及相应正常组织中的表达,并分析其与组织学类型、分级和TNM分期的关系。方法应用免疫组化EnVinsion法检测SLC22A18在96例NSCLC及正常组织中的表达,结果用统计学软件SPSS17.0进行分析。结果 SLC22A18主要定位于胞膜和胞质中。SLC22A18在NSCLC中的表达高于正常组织,差异明显(P<0.01),鳞癌、腺癌阳性率分别为68.0%和78.2%,差异性有统计学意义(P<0.05)。鳞癌、腺癌不同病理分级、TNM分期间SLC22A18表达差异性均有统计学意义,癌组织分化越差、分期越晚,SLC22A18表达越高(P<0.05)。结论 SLC22A18在NSCLC组织中高表达,表达的高低与组织学类型、分级、TNM分期有关,本研究为进一步探讨SLC22A18在肿瘤中的表达及可能的耐药作用提供了实验依据。

印记基因SLC22A18的表达与乳腺癌侵袭能力的关系

目的:研究印记基因SLC22A18(solute carrier family 22,member 18)在乳腺癌中的表达情况及其与乳腺癌侵袭能力的关系。方法:采用Transwell方法评估2种不同恶性程度的乳腺癌细胞株MDA-MB-231(恶性程度高)和MCF-7(恶性程度低)的侵袭转移能力。分别采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测SLC22A18的mRNA和蛋白在这2种乳腺癌细胞株中的表达情况。结果:MDA-MB-231细胞株恶性程度高,穿过膜的细胞多,侵袭能力强;MCF-7细胞株恶性程度低,穿过膜的细胞少,侵袭能力弱;SLC22A18在MCF-7中的mRNA和蛋白表达水平高于MDA-MB-231;差异有统计学意义(P<0.01)。结论:印记基因SLC22A18的表达与乳腺癌细胞的侵袭能力相关,该基因有望作为一个抑癌基因抑制乳腺癌的转移。

应用染色质免疫沉淀技术分析DNMT3b和HDAC1蛋白与SLC22A18基因启动子的结合

目的建立优化的染色质免疫沉淀技术(ChIP),分析乳腺癌细胞MDA-MB-231中DNA甲基转移酶3b(Dnmt3b)和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)与SLC22A18基因启动子区的结合情况。方法建立并优化ChIP实验技术,运用ChIP技术检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-dc)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)分别单独和联合作用于人乳腺癌细胞MDA-MB-231后,用Dnmt3b和HDAC1特异性抗体沉淀DNA,聚合酶链式反应(PCR)检测SLC22A18基因5'端特异性序列,免疫印迹法(Westernblotting)检测Dnmt3b和HDAC1蛋白的表达情况。结果获得了优化的ChIP实验条件,Dnmt3b和HDAC1抗体沉淀的染色质片段中扩增出SLC22A18基因5'端特异性序列。5-aza-dc、TSA单独用药可抑制DNMT3b、HDAC1与SLC22A18启动子区特异序列的结合,5-aza-dc和TSA联合作用可以明显抑制DNMT3b、HDAC1与SLC22A18启动子的结合;Western blotting结果表明,5-aza-dc、TSA单独及联合用药不影响DNMT3b和HDAC1蛋白的表达。结论 DNMT3b和HDAC1在MDA-MB-231细胞内结合于SLC22A18基因启动子的特异区域,参与该基因的表达调控。

SLC22A18基因转染人胶质瘤U251细胞对放疗敏感性的影响

目的:探讨SLC22A18基因转染人胶质瘤U251细胞对放疗敏感性的影响。方法:用脂质体介导的转染技术将pIRES2-EGFP-SLC22A18表达重组质粒导入U251细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)检测SLC22A18基因和蛋白的表达。U251细胞分为4组:对照组、转染组、放疗组和转染联合放疗组。集落形成实验检测各组U251细胞集落形成数,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)和流式细胞仪检测各组U251细胞生长抑制率和凋亡率,进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导的pIRES2-SLC22A18表达重组质粒转染U251细胞对放疗敏感性的影响。结果:重组质粒转染组通过RT-PCR和Western blot证实了SLC22A18基因和蛋白在U251细胞中表达。集落形成实验检测发现SLC22A18基因对U251细胞的集落形成数为(60.6±5.2)个,当放射剂量为3、6和9 Gy时,U251细胞的集落形成数分别为(30.0±3.6)、(13.0±3.0)和(4.0±1.0)个。MTT检测发现SLC22A18基因对U251细胞的生长抑制率为(80.12±5.75)%。当放射剂量为3、6和9 Gy时,U251细胞的生长抑制率分别为(17.05±4.24)%、(17.34±1.62)%和(18.71±4.59)%。当SLC22A18基因与放疗(3、6和9 Gy)联合作用时,抑制率分别为(81.45±5.32)%、(90.45±1.65)%和(92.62±2.12)%。SLC22A18基因转染所产生的U251细胞凋亡率为17.68%。放疗(3、6和9 Gy)引起的细胞凋亡率分别为4.64%、4.87%和5.42%。当SLC22A18基因与放疗(3、6和9 Gy)联合作用时,凋亡率分别为18.42%、21.48%和23.92%。体内实验结果显示,SLC22A18基因对U251细胞6 Gy照射的抑瘤率比较为1.81。结论:SLC22A18基因转染增加了人胶质瘤U251细胞对放疗的敏感性。

5-Aza-CdR上调裸鼠胶质瘤SLC22A18基因的表达及其对胶质瘤的抑制作用

目的探讨去甲基化药物5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对胶质瘤U251细胞SLC22A18表达及对肿瘤生长的影响。方法皮下接种法建立胶质瘤U251细胞裸鼠种植瘤模型,随机分为实验组(12只)和对照组(12只)。实验组裸鼠皮下注射5-Aza-CdR,对照组裸鼠皮下注射等量PBS。4周后处死裸鼠,观察胶质瘤的生长情况,用逆转录PCR技术及免疫组织化学技术检测SLC22A18mRNA及蛋白的表达。结果用药4周后,对照组SLC22A18mRNA表达极低(0.132±0.056),而实验组表达明显增强(0.552±0.124),两者相差显著(P<0.01);对照组几乎检测不到SLC22A18蛋白表达,而实验组可检测到SLC22A18蛋白明显表达;用药4周后实验组肿瘤的体积为(982.52±415.45)mm3,对照组为(1468.56±642.34)mm3,两者相差显著(P<0.05)。结论 5-Aza-CdR能上调裸鼠皮下种植胶质瘤U251细胞的SLC22A18表达,抑制胶质瘤的生长,其机制可能为5-Aza-CdR使甲基化的SLC22A18启动子去甲基化表达,恢复SLC22A18的表达,从而抑制胶质瘤生长。

沉默Bcl-XL逆转人胶质瘤获得性SLC22A18的耐药

目的:探讨RNA干扰Bcl-XL(siRNA)在人胶质瘤获得性SLC22A18的耐药中的作用。方法:以Bcl-XL siRNA转染获得性SLC22A18耐药的人胶质瘤U251-SLC22A18/R细胞,用重组人SLC22A18蛋白处理,MTT法和流式细胞仪检测肿瘤细胞的存活率,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-8的表达情况。结果:Bcl-XL siRNA能够降低U251-SLC22A18/R细胞中Bcl-XL的表达,也能逆转其对SLC22A18的耐药。U251-SLC22A18/R细胞经过Bcl-XL siRNA和重组人SLC22A18蛋白共同处理4 h后细胞凋亡率>50%,细胞存活率<30%;而对照组和重组人SLC22A18蛋白处理组的细胞凋亡率和存活率无明显变化。经Bcl-XL siRNA与重组人SLC22A18蛋白联合处理后,U251-SLC22A18/R细胞中Caspase-3和Caspase-8均明显活化。结论:Bcl-XL siRNA能有效逆转人胶质瘤获得性SLC22A18的耐药,为治疗胶质瘤耐药提供一种新的思路。

不同化疗药物对胶质瘤获得性SLC22A18基因耐药的逆转作用

目的:探讨临床上治疗胶质瘤的不同化疗药物对胶质瘤U251细胞获得性SLC22A18耐药的逆转作用及可能的分子机制。方法:将重组腺病毒载体(Ad)介导的SLC22A18基因联合替莫唑胺(TMZ)、卡氮芥(BCNU)以及顺铂(DDP)3种常见化疗药物处理对Ad/SLC22A18产生耐药的U251-SLC22A18/R胶质瘤细胞,通过MTT比色法检测处理后胶质瘤细胞的存活率,以评估体外不同化疗药物对SLC22A18耐药的逆转作用;在体内进一步评估该逆转策略的有效性;并且通过免疫印迹等方法探讨逆转耐药的可能的分子机制。结果:在体外只有TMZ和BCNU能够使U251-SLC22A18/R细胞对Ad/SLC22A18重新敏感。进一步的研究结果表明联合TMZ和Ad/SLC22A18能在体内有效地抑制U251-SLC22A18/R细胞来源的胶质瘤生长,且联合TMZ和Ad/SLC22A18抑制作用明显比其它对照组强。Ad/SLC22A18和TMZ的联合治疗可以下调MGMT蛋白的表达,并且Ad/SLC22A18和BCNU的联合治疗可以上调Bax蛋白的表达。结论:联合应用Ad/SLC22A18和TMZ或BCNU能在体内外有效地逆转U251-SLC22A18/R细胞对SLC22A18的获得性耐药,TMZ的逆转作用可能与其诱导的MGMT蛋白低表达有关,BCNU的逆转作用可能与其诱导的Bax蛋白过度表达有关。

胶质瘤SLC22A18耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究

目的:以人胶质瘤U251细胞株为载体,探讨胶质瘤获得性SLC22A18基因耐药的可能机制。方法:用重组腺病毒介导的SLC22A18基因(Ad/SLC22A18)反复处理人胶质瘤U251细胞,得到人胶质瘤耐药细胞株U251-SLC22A18/R。通过MTT和Western blot法检测耐药细胞U251-SLC22A18/R对Ad/SLC22A18杀伤作用的敏感性及凋亡相关的信号分子DR4、DR5、Bax、Bcl-XL和caspase-8的表达情况,分析其获得性耐药的可能机制。结果:耐药细胞U251-SLC22A18/R对Ad/SLC22A18和SLC22A18蛋白处理耐药,但对Bax基因处理仍然敏感。U251-SLC22A18/R细胞内Bcl-XL的表达显著升高,caspase-8的表达明显下降,caspase-8活性未见明显的裂解。结论:人胶质瘤U251细胞株经Ad/SLC22A18反复处理后产生针对SLC22A18基因的耐药,其机制可能与Bcl-XL表达升高和caspase-8表达下降有关。

猪Slc22a18与Slc22a3的克隆及印迹表达分析

本试验通过鉴定候选印迹基因Slc22a18与Slc22a3,以丰富猪中已鉴定印迹基因的数量,为今后在猪中的印迹研究提供基础。本研究采用单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)直接测序法检测了猪Slc22a18与Slc22a3在16个组织器官中的印迹状态。首先,克隆得到657bp的Slc22a18cDNA序列及1 077bp的Slc22a3cDNA序列,然后进行SNP直接测序法检测。Slc22a18在1月龄仔猪的组织器官中为双等位基因表达,而在45d胎盘中为母源等位基因表达。Slc22a3的表达具有母源偏好性。实时定量PCR显示,Slc22a18在各组织器官中表达水平差异很大,在肝、肾和小肠中表达水平显著高于其他各组织,Slc22a3在各组织器官中广泛表达。上述结果表明,Slc22a18与Slc22a3在猪不同组织器官中存在印迹多态性,是猪母源表达的印迹基因。

SLC22A18基因启动子甲基化与胶质瘤SLC22A18表达的关系

目的探讨胶质瘤中SLC22A18基因启动子甲基化与其表达的关系。方法选取上海交通大学医学院附属第三人民医院神经外科自2006年9月至2009年6月、武汉大学中南医院神经外科自2002年9月至2005年6月间手术切除的胶质瘤标本30例，另选10例行内减压术颅脑损伤患者的正常脑组织作为对照。采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测标本中SLC22A18基因启动子甲基化的状态．RT—PCR和Western blotting分别检测SLC22A18 mRNA和蛋白的表达。体外培养胶质瘤U251细胞于含2μmol／L去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine的培养液（实验组）中，同时设普通培养液作对照，培养3、5、7d后进行细胞计数并应用Western blotting检测SLC22A18蛋白的表达。结果MSP检测结果显示15例胶质瘤组织出现甲基化．对照脑组织均表现出非甲基化；15例甲基化胶质瘤组织中SLC22A18mRNA、蛋白的表达明显低于对照脑组织。培养5、7d实验组U251细胞计数少于对照组，差异有统计学意义f氏0．05）。培养7dWestern blotting检测结果发现实验组细胞SLC22A18蛋白的表达明显高于对照组。结论观c22AJ8基因启动子甲基化导致其表达下调；去甲基化药物能恢复U251细胞SLC22A18的表达，并抑制U251细胞增殖。

SATB1基因在星形细胞瘤组织中的表达及与SLC22A18蛋白表达的关系

目的探讨星形细胞瘤组织中特异性的核基质结合区结合蛋白-1（SATB1）基因、SLC22A18蛋白的表达、与肿瘤恶性程度及两者之间的相互关系。方法选取上海交通大学医学院附属第三人民医院神经外科自2006年9月至2010年6月、武汉大学中南医院神经外科自2003年9月至2006年6月间手术切除的星形细胞瘤标本56例，其中WHO分级I级12例．Ⅱ级13例，Ⅲ级15例，Ⅳ级16例。另选10例行内减压术颅脑损伤患者的正常脑组织作为对照组。应用RT-PCR和Westernblotting分别检测各标本中SATBlmRNA和蛋白的表达，免疫组织化学法检测各标本中SLC22A18蛋白的表达，分析二者与肿瘤恶性程度及两者之间的相互关系。结果RT-PCR与Westernblotting检测显示对照组脑组织中SATB1mRNA和蛋白有少许表达，星形细胞瘤中35例表达阳性；不同级别星形细胞瘤SATBlmRNA和蛋白的阳性表达率、表达值不同，且随着肿瘤病理级别的增高，SATBlmRNA和蛋白的表达值增强，差异有统计学意义（P〈0．05）。SATB1蛋白的表达值与肿瘤的病理级别呈正相关关系（r=0．987，P=-0．000）；免疫组织化学法检测显示对照组均检测到SLC22A18表达，星形细胞瘤中19例SLC22A18表达阳性。不同级别星形细胞瘤SLC22A18的阳性表达率不同，随着肿瘤病理级别的增高．SLC22A18的阳性表达率降低，差异有统计学意义（P〈0．05）；SLC22A18表达阴性组中SATB1蛋白阳性表达率（81．1%）显著高于SLC22A18表达阳性组（26.3％），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论SATB1基因在星形细胞瘤中表达，提示该基因对星形细胞瘤发生和发展起重要作用；抑癌基因SL22AJ8的失活与SATBJ基因的表达可能在星形细胞瘤的发生中起协同作用。

印迹基因SLC22A18在乳腺癌中的表达及其意义

目的研究印迹基因SLC22A18在乳腺浸润性导管癌中mRNA和蛋白水平的表达，并分析SLC22A18表达与乳腺癌临床病理特征之间的相关性，从而探讨SLC22A18基因在乳腺癌发生发展中的作用。方法应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应方法检测46例乳腺浸润性导管癌和对应癌旁乳腺组织，以及20例乳腺良性病变组织中SLC22A18 mRNA的表达，应用免疫组织化学方法检测46例乳腺浸润性导管癌组织、20例乳腺良性病变中SLC22A18蛋白表达，分析SLC22A18 mRNA和蛋白表达与乳腺癌临床病理特征间的关系。结果SLC22A18在46例乳腺浸润性导管癌中mRNA表达量低于癌旁组织（Z=-4．900，P〈0．01）；46例乳腺浸润性导管癌中SLC22A18 mRNA表达量低于乳腺良性病变（Z=-3．182，P〈0．01）。40例乳腺浸润性导管癌中SLC22A18 mRNA表达量低于6例导管内癌灶性浸润（Z=-2．022，P〈0．05）。SLC22A18蛋白在20例乳腺良性病变、46例乳腺浸润性导管癌中表达阳性率分别为95％、69．6％，两组阳性表达率差异有统计学意义（X^2=5．135，P〈0．05）。SLC22A18 mRNA和蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、TNM分期及淋巴结转移均无相关性（P〉0．05）。结论SLC22A18在乳腺浸润性导管癌中表达下调，SLC22A18可能参与了乳腺癌的发生，并有可能成为乳腺癌早期诊断的新分子标志物。

非小细胞肺癌组织SLC22A18表达与耐药相关性研究

目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中SLC22A18的表达与组织学类型、病理分级的关系,以及与相应癌组织对化疗药物敏感性的相关性。方法:应用免疫组化EnVinsion法,检测第四军医大学唐都医院胸外科2005-10-1-2006-06-30手术切除96例NSCLC组织中SLC22A18表达;MTT法检测相应96例癌组织对9种化疗药物的敏感性,分析其与SLC22A18表达的相关性。结果:SLC22A18主要定位于胞膜上和胞质中。在鳞癌、腺癌组织中阳性率分别为68.0%(34/50)和78.2%(36/46),差异有统计学意义,P=0.015。鳞癌Ⅱ、Ⅲ级组织阳性率分别为54.2%(13/24)和80.8%(21/26),差异有统计学意义,P=0.041。腺癌中分化、低分化阳性率分别为69.6%(16/23)和86.9%(20/23),差异有统计学意义,P=0.007。NSCLC组织SLC22A18的表达与其相应组织药物敏感性试验做两因素方差分析,其中环磷酰胺、5-FU、紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛和卡铂的P值分别为0.002、<0.001、0.005、0.043、0.001和0.028。结论:SLC22A18在NSCLC组织中高表达,在腺癌中的表达率高于鳞癌,分化越差,表达越高;NSCLC组织中SLC22A18的表达对组织耐药性的产生发挥作用。

脑胶质瘤组织中SLC22A18与缺氧诱导因子-1α的表达及意义

目的探讨SLC22A18与缺氧诱导因子(HIF)-1α在正常脑组织和脑胶质瘤组织中的表达规律,探讨其与肿瘤临床病理的关系和生物学特性。方法采用免疫组化法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测62例胶质瘤和10例正常脑组织中SLC22A18与HIF-1α的表达情况,并结合临床病理进行分析。结果 SLC22A18蛋白和mRNA的表达随病理级别的增高而明显减弱,而HIF-1α蛋白和mRNA的表达随病理级别的增高而明显增强。免疫组织化学结果示SLC22A18在正常脑组织和Ⅰ~Ⅳ级胶质瘤中的阳性表达率分别为100%、81.3%、57.1%、14.3%、0,各组间差异均有统计学意义(χ2=39.65,P<0.05);同样,HIF-1α在各组中的阳性表达率分别为10%、12.5%、57.1%、85.7%、100%,正常脑组织和Ⅰ级胶质瘤间差异无统计学意义,其余各组间差异均有统计学意义(χ2=48.86,P<0.05)。RT-PCR结果示正常脑组织和Ⅰ~Ⅳ级胶质瘤中SLC22A18 mRNA平均吸光度值分别为121.94、92.68、47.25、12.06、8.56,各组间差异均有统计学意义(F=987.64,P<...

SLC22A18基因对人胶质瘤U251细胞化疗药物敏感性的影响

目的:探讨印记基因SLC22A18(solute carrier family 22,member 18)对人胶质瘤U251细胞化疗药物敏感性的影响及耐药机制的研究。方法:采用脂质体转染法将携带有SLC22A18基因的重组质粒pIRES2-EGFP-SLC22A18转入U251细胞;分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测SLC22A18 mRNA及蛋白在转染后U251细胞中的表达情况;CCK-8法检测细胞对化疗药物敏感性的变化;FCM法检测SLC22A18表达对细胞凋亡以及对多柔比星在细胞内蓄积浓度的影响。结果:转染SLC22A18基因的U251细胞中有SLC22A18 mRNA及其蛋白的表达;SLC22A18基因转染组U251细胞与对照组细胞比较,U251细胞对紫杉醇的敏感性下降,半数抑制浓度(halfinhibitory concentration,IC50)值上升(t=3.23,P<0.05),对替莫唑胺的敏感性上升,IC50值下降(t=4.28,P<0.05)。SLC22A18基因转染组和空质粒转染组细胞凋亡率分别为(41.35±4.98)%和(6.25±0.82)%,差异有统计学意义(t=12.05,P<0.01)。SLC22A18表达使细胞内多柔比星蓄积浓度明显下降(t=4.25,P<0.05)。结论:SLC22A18表达使人胶质瘤U251细胞对紫杉醇的敏感性下降,对替莫唑胺的敏感性提高,并可能通过降低细胞内化疗药物蓄积产生耐药性。