目的利用CRISPR/Cas9技术构建牛磺酸转运体基因(solute carrier family 6 member 6,Slc6a6)敲除大鼠,繁殖并鉴定,为研究牛磺酸缺失对神经系统疾病的影响提供稳定的大鼠模型。方法针对Slc6a6基因第5外显子,设计向导RNA(single-guide RNA,...目的利用CRISPR/Cas9技术构建牛磺酸转运体基因(solute carrier family 6 member 6,Slc6a6)敲除大鼠,繁殖并鉴定,为研究牛磺酸缺失对神经系统疾病的影响提供稳定的大鼠模型。方法针对Slc6a6基因第5外显子,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)介导Cas9核酸酶与靶点DNA特异性结合,并切割基因组DNA,被切割后的DNA进行重组修复,从而实现基因的敲除。通过基因型鉴定和测序分析检测新生大鼠基因型。利用Real-time PCR、Western blot技术和免疫组化等方法,分析大鼠脑组织的牛磺酸转运体(taurine transporter,TauT)的mRNA表达和蛋白表达,建立Slc6a6基因敲除大鼠模型。结果 F3代出现21只Slc6a6基因敲除纯合子(TauT^(-/-)),54只杂合子(TauT^(+/-)),27只阴性(TauT^(+/+)),F3代纯合率约为20.59%,基本符合孟德尔遗传定律。Slc6a6基因敲除纯合子大鼠脑组织mRNA水平基本不表达,TauT蛋白表达水平显著低于同窝阴性大鼠。结论本研究利用CRISPR/Cas9系统定向敲除Slc6a6基因,成功构建Slc6a6基因敲除大鼠模型。展开更多
目的研究微RNA(microRNA,miRNA)-32-5p(miR-32-5p)对载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠动脉粥样硬化的作用及其是否通过信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/...目的研究微RNA(microRNA,miRNA)-32-5p(miR-32-5p)对载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠动脉粥样硬化的作用及其是否通过信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)通路影响巨噬细胞极化与动脉粥样硬化之间的联系。方法将6~8周龄动脉粥样硬化雄性ApoE^(-/-)小鼠随机分为实验组和模型组,实验组通过给小鼠注射miR-32-5p慢病毒构建过表达模型,模型组注射同等剂量生理盐水。4周后解剖小鼠,留取主动脉组织常规石蜡切片,采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin staining,HE)染色、免疫组化、免疫荧光法分别检测主动脉斑块面积及斑块内巨噬细胞含量;通过Western blotting(WB)检测主动脉斑块和体外培养巨噬细胞中磷酸化的信号转导和转录活化因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)、PTEN、CCAAT增强子结合蛋白β(CCAT/enhancer-binding protein beta,C/EBP-β)等相关蛋白表达量。结果与模型组相比,实验组小鼠主动脉斑块面积明显缩小(Z=-3.477,P<0.01)、斑块内巨噬细胞数减少(Z=-3.628,P<0.01)、巨噬细胞向M2表型转化(Z=-3.628,P<0.01)。WB提示实验组p-STAT3(t=-10.381,P<0.01)、C/EBPβ(t=-6.205,P<0.01)表达量升高,而PTEN(t=7.057,P<0.01)表达量降低;M2型巨噬细胞标记物甘露糖受体/CD206(mannose receptor/CD206)(t=-5.386,P<0.01)、精氨酸酶(arginase)(t=-4.486,P<0.01)、发现于炎症区域(found in inflammatory zone,FIZZ)(t=-5.701,P<0.01)的表达量升高;体外实验同样显示实验组CD206(t=-11.431,P<0.01)、p-STAT3(t=-12.401,P<0.01)、C/EBP-β(t=-4.755,P<0.01)表达升高,PTEN(t=21.729,P<0.01)表达降低。结论miR-32-5p过表达可通过激活STAT3通路抑制PTEN,促进巨噬细胞向M2表型转化,发挥保护动脉粥样硬化的作用。展开更多
文摘目的研究微RNA(microRNA,miRNA)-32-5p(miR-32-5p)对载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠动脉粥样硬化的作用及其是否通过信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)通路影响巨噬细胞极化与动脉粥样硬化之间的联系。方法将6~8周龄动脉粥样硬化雄性ApoE^(-/-)小鼠随机分为实验组和模型组,实验组通过给小鼠注射miR-32-5p慢病毒构建过表达模型,模型组注射同等剂量生理盐水。4周后解剖小鼠,留取主动脉组织常规石蜡切片,采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin staining,HE)染色、免疫组化、免疫荧光法分别检测主动脉斑块面积及斑块内巨噬细胞含量;通过Western blotting(WB)检测主动脉斑块和体外培养巨噬细胞中磷酸化的信号转导和转录活化因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)、PTEN、CCAAT增强子结合蛋白β(CCAT/enhancer-binding protein beta,C/EBP-β)等相关蛋白表达量。结果与模型组相比,实验组小鼠主动脉斑块面积明显缩小(Z=-3.477,P<0.01)、斑块内巨噬细胞数减少(Z=-3.628,P<0.01)、巨噬细胞向M2表型转化(Z=-3.628,P<0.01)。WB提示实验组p-STAT3(t=-10.381,P<0.01)、C/EBPβ(t=-6.205,P<0.01)表达量升高,而PTEN(t=7.057,P<0.01)表达量降低;M2型巨噬细胞标记物甘露糖受体/CD206(mannose receptor/CD206)(t=-5.386,P<0.01)、精氨酸酶(arginase)(t=-4.486,P<0.01)、发现于炎症区域(found in inflammatory zone,FIZZ)(t=-5.701,P<0.01)的表达量升高;体外实验同样显示实验组CD206(t=-11.431,P<0.01)、p-STAT3(t=-12.401,P<0.01)、C/EBP-β(t=-4.755,P<0.01)表达升高,PTEN(t=21.729,P<0.01)表达降低。结论miR-32-5p过表达可通过激活STAT3通路抑制PTEN,促进巨噬细胞向M2表型转化,发挥保护动脉粥样硬化的作用。
