致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86SLT-ⅡeA基因的克隆与表达

为了克隆与表达致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位(SLT-ⅡeA)基因,试验以F107/86为模板,PCR扩增去掉信号肽的935 bp的SLT-ⅡeA亚单位基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ与SalⅠ位点之间并测序,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:对筛选出的阳性重组质粒pGEX-SLT-ⅡeA-4测序并与GenBank登录的M36727序列比较,证明插入序列及读码框正确;表达产物GST-SLT-ⅡeA经SDS-PAGE分析其大小为58.3 ku;Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫原性。说明试验所构建的原核表达载体可大量表达抗原蛋白。

SLT-IIeA基因在原核系统中的克隆与表达及其鉴定

PCR扩增并克隆在 p UC1 8质粒中的类志贺样毒素 II型变异体 ( SL T-IIe) A亚单位基因片段切出 ,按预定阅读框架插入到原核性表达载体 p GEX-6p-1的谷胱甘肽 S-转移酶( GST)基因的下游 ,获得重组质粒 pp GEX-A。重组质粒导入大肠杆菌 BL2 1 ,用 IPTG进行诱导表达 ,通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS-PAGE电泳分析及 Western-blot鉴定 ,表明重组菌能大量表达融合蛋白形式的 SL T-IIe A,即 SL T-IIe A蛋白与谷胱甘肽转移酶相连组成的蛋白质。本实验的研究结果 ,为进一步研究 SL T-IIe的生物学特性及研制仔猪水肿病亚单位苗提供了有效的生物材料。

志贺样毒素II型变异体A亚单位单抗的制备

将表达志贺样毒素II型变异体A亚单位重组蛋白的菌株ppSLT -IIeA在含氨苄青霉素的 2×YTA培养基中培养 ,至对数生长期时加入IPTG诱导 ,诱导的重组菌超声波裂解后 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达重组蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白 ,测定纯化蛋白的浓度 ,免疫BALB/c小鼠 ,细胞融合后经ELISA检测 ,得到一株阳性杂交瘤细胞 ,命名为A2 _D3 ,制备的单抗腹水ELISA效价为 2 4log2 ,免疫印迹结果表明此单抗仅与重组蛋白反应 ,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测 13株水肿病菌株 。