宫颈癌组织中Slug基因及其蛋白质的表达与意义

目的检测Slug基因在宫颈癌和慢性宫颈炎症组织中的表达,探讨其与宫颈癌发生、发展的相关性及在宫颈癌诊疗中的意义。方法收集31例宫颈癌组织和17例慢性宫颈炎症组织标本,用RT-PCR、实时定量PCR检测Slug mRNA的表达;用western blot分析Slug蛋白的表达水平,并分析Slug mRNA在宫颈癌中的表达水平与临床病理因素及高危型HPV病毒载量的相关性。结果宫颈癌组织中Slug mRNA表达阳性率及相对表达水平均显著高于慢性宫颈炎症组织(χ2=9.872;U=140,P均<0.01);western blot也证实Slug蛋白表达水平高于慢性宫颈炎症组织(U=98,P<0.01)。在宫颈癌组织中,Slug的阳性表达与国际妇产科学联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)肿瘤分期相关,Ⅱ期阳性率高于Ⅰ期(χ2=4.037,P<0.05),与年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴细胞转移和病理类型无关;而Slug基因相对表达水平与高危型HPV病毒载量呈正相关(r=0.554,P<0.01)。结论宫颈癌组织中Slug的表达上调,且与宫颈癌的FIGO分期相关,在宫颈癌的发生机制中,可能存在Slug和高危型HPV的协同作用。

siRNA干扰Slug基因表达对胰腺癌BxPC-3细胞放射敏感性的影响

目的:探讨siRNA干扰Slug基因表达对BxPC-3细胞γ射线敏感性的影响.方法:制备携带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的siRNA-Slug质粒载体,用脂质体转染法将siRNA-Slug(实验组)、pGCL-GFP(阴性对照)导入BxPC-3细胞(空白对照组),G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆.将转染载体的BxPC-3阳性克隆细胞和未转染载体的BxPC-3细胞采用60Coγ射线对其进行照射3Gy.RT-PCR和Westernblot检测不同组细胞经γ射线后的Slug、PUMA表达,MTT检测细胞生长抑制,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡.结果:实验组细胞内Slug基因被有效沉默;实验组细胞内PUMA蛋白和PUMAmRNA的相对值明显高于对照组(0.98±0.15vs0.32±0.08,1.03±0.16vs0.38±0.08,均P<0.05).实验组细胞生长抑制率和凋亡率分别高于对照组(37.46%±9.63%vs2.13%±0.12%,32.4%±9.5%vs3.47%±0.18%,均P<0.05).实验组细胞受到γ射线作用后,PUMAmRNA和PUMA蛋白表达明显增加,分别为1.26±0.18和1.23±0.18,生长抑制率和凋亡率增加,分别为78.4%±18.5%和73.3%±17.4%,与射线作用的对照组和阴性对照组比,差异均有统计学意义(均P<0.01).结论:siRNA干扰Slug基因后,解除Slug对PUMA基因的抑制,增强BxPC-3对γ射线的敏感性.

Twist、Slug基因在宫颈癌中的表达及与预后的关系

目的探讨Twist、Slug基因在宫颈癌中的表达水平及与临床预后的关系。方法用实时定量PCR检测56例宫颈癌患者、120例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者组织和血浆中Twist、Slug mRNA的表达,以35例正常宫颈及慢性宫颈炎组织和血浆作为对照。免疫组化染色检测Twist、Slug蛋白在宫颈癌组织中的表达,并分析其与宫颈癌复发的关系。结果对照组、CIN组、宫颈癌组组织中Twist mRNA表达水平分别为(1.98±0.48)×10-3、(3.89±0.86)×10-3、(6.53±1.25)×10-3,血浆中Twist mRNA表达水平分别为(1.62±0.55)×10-4、(1.76±0.68)×10-4、(2.08±0.90)×10-4;3组组织中Slug mRNA表达水平分别为(1.33±0.32)×10-2、(3.02±0.95)×10-2、(4.69±1.02)×10-2,血浆中Slug mRNA表达水平分别为(2.08±0.75)×10-3、(2.30±0.78)×10-3、(3.09±1.02)×10-3;宫颈癌组、CIN组组织中Twist、Slug mRNA表达水平均高于对照组(F分别为46.69、55.30,P<0.01);宫颈癌组血浆中Twist、Slug mRNA相对表达水平最高(F分别为10.56、17.97,P<0.01),且术前血浆中Twist、Slug相对表达水平高于术后2周的水平(t分别为2.12、2.03,P<0.05)。宫颈癌组Twist mRNA与Slug mRNA呈正相关(r=0.483,P<0.01);免疫组化结果表明,宫颈癌组织Twist、Slug蛋白表达阳性率(55.4%、78.6%)高于对照组的表达阳性率(8.6%、37.1%)(χ2分别为20.15、15.80,P<0.01)。宫颈癌组Twist蛋白阳性者复发率高于Twist蛋白阴性者(29.0%vs 4.0%,χ2=5.91,P<0.05)。结论 Twist、Slug基因在宫颈癌组织和血浆中表达上调,Twist阳性表达与宫颈癌的复发关系密切。

靶向Slug基因腺相关病毒载体的构建及其抑制视网膜母细胞瘤细胞生长的体外研究

目的构建并制备携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体。方法首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316-EGFP-Slug-siRNA克隆为模板扩增EGFP-Slug-siRNA片段,EcoRI和SalI双酶切后回收PCR产物。酶切pSNAV2.0-LacZ-α载体质粒,并与上述产物进行连接。转化感受态大肠杆菌DH5α,得到重组质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,酶切和测序对其进行鉴定。建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA,大规模制备rAAV2-EGFP-Slug-siRNA并对其纯化、鉴定和滴度测定。将体外培养的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)细胞转染rAAV-EGFP-Slug-siRNA和pSNAV2.0-EGFP空载体。鸡胚绒毛尿囊膜实验检测血管生成,MTT比色法检测细胞存活率,建立鸡胚绒毛尿囊移植瘤。结果携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确。将构建成功的载体质粒与重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc/UL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出重组腺相关病毒rAAV2-EGFP-Slug-siRNA,经检测目的片段插入成功,滴度为90.21×109puf。Slug-siRNA有效抑制RB细胞内Slug表达后,肿瘤血管密度明显降低,血管生成被抑制,细胞存活率明显降低。实体瘤血管生成和生长受到抑制。结论成功制备出高滴度的携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体。干扰Slug可抑制肿瘤血管生成,抑制RB细胞的生长增殖。

Slug基因在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变组织中的表达与意义

目的研究转录因子Slug mRNA在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变(CIN)组织中的表达情况及意义。方法采用实时定量PCR方法检测56例宫颈癌组织、60例CIN组织中Slug mRNA的相对表达量,以35例正常宫颈组织及慢性宫颈炎组织作为对照,并分析其与宫颈癌各临床病理参数的相关性。结果对照组、CIN组、宫颈癌组Slug mRNA相对表达水平分别为(1.33±0.32)×10-2、(2.99±0.95)×10-2、(4.69±1.02)×10-2,宫颈癌组、CIN组Slug mRNA相对表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);宫颈癌组Slug mRNA相对表达水平高于CIN组,差异有统计学意义(P<0.01)。宫颈癌组织中Slug的表达与国际妇产科学联盟(FIGO)分期、淋巴结转移相关,差异有统计学意义(P<0.05),但与年龄、肿瘤大小、病理类型、分化程度无关,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Slug基因在CIN、宫颈癌组织中表达上调,可能与宫颈癌的发生、发展及转移密切相关。

靶向Slug基因的腺相关腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并制备携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.方法:首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316-EGFP-Slug-siRNA克隆为模板扩增EGFP-Slug-siRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收的PCR产物;酶切pSNAV2.0-lacz-α载体质粒,并与上述产物进行连接;转化感受态大肠杆菌DH5α,得到重组质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,酶切和测序对其进行鉴定.建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA,大规模制备rAAV2-EGFP-Slug-siRAN并对其纯化、鉴定和滴度测定.结果:携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确.将构建成功的载体质粒与重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc/?UL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出重组腺相关病毒rAAV2-EGFP-Slug-siRNA,经检测目的片段插入成功,滴度为9.23×1010puf.结论:成功制备出高滴度的携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.

SLUG基因可调控性干扰载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的 探讨鼻咽癌细胞中基因表达,构建可调控性相关基因干扰载体,并验证其干扰作用。方法 将高转移人鼻咽癌细胞株5-8F、5-8F-H3细胞进行培养,实时荧光定量RT-PCR检测5-8F及5-8F-H3细胞中SLUG、CBX3、MAD2L1、PLAU、HMGA1基因的表达水平。应用酶切、连接技术构建pSUPERIOR-SLUG干扰载体,采用脂质体转染方法转染5-8F-H3细胞,经嘌呤霉素筛选获得阳性克隆,实时荧光定量RT-PCR检测干扰效果。结果 5-8F及 5-8F-H3细胞中SLUG基因表达水平均明显高于CBX3、MAD2L1、PLAU、HMGA1基因(均P<0.05),相对倍数分别为(11.23±1.78)倍、(1.23±0.17)倍、(1.57±0.27)倍、(6.36±0.38)倍、(3.66±1.14)倍,以SLUG基因倍数最高。所构建的pSUPERIOR-SLUG重组质粒,经酶切鉴定及序列分析证实为所需的目标序列,并成功转染鼻咽癌5-8F-H3细胞。阳性克隆S2-18基因表达水平高于阳性克隆S1-7、S1-9、S2-22基因(P<0.05),干扰率分别为67.42%、72.45%、84.20%、75.61%。结论 SLUG基因在鼻咽癌5-8F-H3中高表达。成功构建了重组质粒——pSUPERIOR-SLUG,并成功转染鼻咽癌5-8F-H3细胞,为后续进一步研究SLUG在鼻咽癌的作用奠定了基础。

过表达和敲除SLUG基因卵巢癌SKOV3细胞稳定株的建立

目的利用慢病毒载体和改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统分别构建过表达和敲除SLUG基因的卵巢癌SKOV3细胞稳定株。方法 (1)以质粒p CMV-Myc-SLUG为模板扩增出HA-SLUG基因,将其连接到慢病毒表达质粒p LVX-IRES-Hyg中。将此重组表达载体p LVX-HA-SLUG通过病毒感染法感染SKOV3细胞(实验组),以相同条件制备p LVX-IRES-Hyg空载体的慢病毒作为阴性对照,Western blotting法检测两组SLUG蛋白表达。(2)将一对能特异结合SLUG基因的sgRNA分别连接到载体PX462中,获得的一对重组质粒通过脂质体法共转染SKOV3细胞,筛选稳定株,挑取单克隆细胞(实验组),用Western blotting法检测SLUG蛋白表达,另设空白对照组,不加任何处理。结果 (1)对挑取的单克隆菌液进行PCR扩增,阳性者提取质粒进行PCR和双酶切,两者验证正确后进行DNA测序鉴定,结果证实重组质粒构建成功。阴性对照组与实验组SLUG蛋白相对表达量分别为0.92±0.02和3.14±0.04,实验组SLUG蛋白表达高于阴性对照组(P<0.01)。(2)挑取4个单克隆细胞进行测定,SLUG蛋白的相对表达量分别为0.07±0.01、0.06±0.01、0.21±0.02、0.20±0.01,空白对照组为0.56±0.03。实验组SLUG蛋白相对表达量低于空白对照组(P均<0.01)。结论过表达和稳定敲除SLUG基因的SKOV3细胞株构建成功,为进一步探讨SLUG在卵巢癌中的作用提供了细胞模型。

siRNA干扰slug基因表达对IEC-6细胞放射线敏感性影响

目的探讨siRNA干扰slug基因表达对体外肠隐窝上皮细胞IEC-6接受X线照射的敏感性影响及其机制。方法以体外培养大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6为研究对象,将转染siRNA-slug(实验组)、转染siRNA(阴性对照组)和未转染siRNA(空白对照组)的细胞进行X射线照射处理,24h后,用Western blot法检测各组细胞的Slug和细胞P53正向凋亡上调因子(PUMA)蛋白的表达,CCK8法检测细胞在不同剂量X射线照射下的生长抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果实验组Slug蛋白表达与阴性对照组和空白对照组比较明显降低,PUMA蛋白表达明显高于阴性对照组和空白对照组,差异有显著性(F=1 760、421,P<0.01)。与阴性对照组和空白对照组比较,实验组细胞的凋亡率增加,差异有统计学意义(F=33.02,P<0.01)。在0~6Gy剂量范围内,随着X线照射剂量的增加,各组细胞的增殖活性均降低(F=6.595~31.470,P<0.05);在6Gy剂量X线照射下,实验组细胞生长抑制率、早期+晚期凋亡率较阴性对照组和空白对照组明显增高,差异有统计学意义(F=47.700、33.020,P<0.01)。结论 siRNA干扰slug基因的表达能够使促凋亡的PUMA蛋白表达增加,从而增强IEC-6细胞对X射线的敏感性。

靶向Slug基因的腺相关腺病毒载体的构建及其抑制胃癌细胞BGC-823生长的体外研究

目的构建携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA载体。方法构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,扩增和回收EGFP-Slug-siRNA片段;酶切pSNAV2.0-lacz-oα载体质粒,并与上述产物进行连接;转化感受态大肠杆菌DH5α,得到pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,酶切和测序对其进行鉴定。制备rAAV2-EGFP-Slug-siRAN并对其纯化、鉴定和滴度测定。将BGC-823转染rAAV-EGFP-Slug-siRNA和pSNAV2.0-EGFP;鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验检测血管生成,MTT比色法检测细胞存活率。结果质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确。将构建成功的载体质粒与HSV1-rc/UL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出rAAV2-EGFP-Slug-siRNA,经检测目的片段插入成功。Slug-siRNA有效抑制BGC-823细胞内Slug表达后,肿瘤血管生成被抑制,细胞存活率明显降低。结论成功制备出高滴度的携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体。干扰Slug可抑制肿瘤血管生成,抑制胃癌细胞BGC-823的生长增殖。

靶向Slug基因诱导PUMA上调增强AsPC-1细胞对γ射线的敏感性研究

目的 探讨siRNA干扰Slug基因表达对胰腺癌AsPC-1细胞γ射线敏感性的影响.方法 以0、10、50、100感染复数（MOI）的rAAV-EGFP-Slug-siRNA（Slug-siRNA）转染AsPC-1细胞72 h,免疫组织化学法和Western blotting检测转染前后细胞内Slug和PUMA表达.采用4 Gy γ射线细胞进行照射,MTT比色法和Hoechst 33342和PI双染法检测对照组、转染组（MOI 50）、照射组、转染（MOI 50）＋照射组细胞存活率和凋亡率,DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,Giemsa染色观察细胞形态.结果 细胞受到MOI为10、50、100作用72 h后,Slug蛋白表达相对值分别为0.831±0.14、0.546±0.12和0.178±0.08,明显低于对照组1.17±0.152,差异有统计学意义（F=4.992,P＜0.05）;而细胞受到MOI为10、50、100作用72 h,PUMA蛋白表达相对值分别为0.325±0.07、0.593±0.11和0.978±0.12,明显高于对照组0.143±0.04,差异有统计学意义（F=4.324,P＜0.05）;转染（MOI 50）＋照射组细胞增殖抑制率为（78.76±9.36）%,明显高于转染组和单独射线照射组[（43.68±6.71）%和（19.25±3.72）%],差异有统计学意义（F=5.056,P＜0.05）.另外,转染（MOI 50）＋照射组细胞的凋亡现象较其他组更加明显.结论 siRNA干扰Slug基因表达能够解除Slug对PUMA的抑制,增强胰腺癌细胞对γ射线的敏感性.

RNA沉默Slug基因对人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭及血管生成的影响

目的:研究Slug-shRNA-1干扰Slug基因对MCF-7侵袭潜力及诱导血管内皮细胞形成管腔能力的影响。方法:通过体外侵袭模型,测定MCF-7通过Slug-shRNA-1作用于Slug基因后穿透Matrigel的潜力;应用MCF-7与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)双室联合培养技术,观察MCF-7通过Slug-shRNA-1作用于Slug基因后诱导HUVEC形成管腔能力的影响。结果:siRNA-Slug作用于Slug基因后能明显降低MCF-7穿透Matrigel的能力(P<0.05),抑制MCF-7诱导HUVEC形成管腔样结构的能力(P<0.05)。结论:Slug-shRNA-1作用于Slug基因后能明显降低MCF-7的侵袭潜力,抑制MCF-7诱导管腔形成能力。

靶向抑制Slug基因表达对BxPC-3细胞凋亡和对5-FU化疗敏感性影响的实验研究

目的:探讨siRNA干扰Slug基因表达对BxPC-3细胞增殖、凋亡和对5-FU化疗敏感性的影响。方法:用脂质体转染法将表达siRNA-Slug的真核表达载体pGenesil-1-Slug-siRNA(pSlug-siRNA)和空载体pGen-esil-1-Neg-siRNA(pNeg-siRNA)导入胰腺癌BxPC-3细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆。将转染载体的BxPC-3阳性克隆细胞和未转染载体的BxPC-3细胞分别暴露于系列浓度(0.01～100μmol/L)的5-FU72h。RT-PCR和蛋白质印迹法检测不同组细胞经5-FU作用72h后的Slug表达;MTT法测定各组细胞生存率并计算IC50,Hoechst33258和PI双染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡。结果:实验组细胞内Slug基因被有效沉默;BxPC-3、Bx-PC-3/pSlug-siRNA和BxPC-3/pNeg-siRNA细胞的5-FUIC50分别为(11.0±2.1)、(1.5±0.4)和(9.7±1.3)μmol/L(P<0.05).BxPC-3/pSlug-siRNA细胞对5-FU作用的敏感性增加了7.33倍。5-FU以剂量依赖方式诱导BxPC-3细胞凋亡,但对BxPC-3/pSlug-siRNA细胞所诱导的凋亡比BxPC-3和BxPC-3/pNeg-siRNA更明显。结论:靶向抑制Slug基因表达促进胰腺癌BxPC-3细胞凋亡,并增强BxPC-3对5-FU的化疗敏感性。

转录因子Snail、Slug在人宫颈癌上皮-间质转化中的作用

目的探讨调控因子Snail、Slug对E-钙黏蛋白的调控和参与人宫颈癌细胞转移侵袭的机制。方法对20例正常宫颈组织标本及85例宫颈鳞癌标本制成石蜡包埋切片,采用免疫组织化学染色方法检测Slug基因和间质标志物波形蛋白(Vimentin)的表达;采用免疫荧光化学染色检测转录因子Snail蛋白和上皮标志物E-cadherin的表达。结果在宫颈鳞癌组织中Slug蛋白和Vimentin的阳性表达率明显高于正常宫颈组织(P<0.05),随着临床分期增高,其阳性表达率有升高趋势,但未达到统计学差异(P>0.05)。随着组织分化级别下降和肿瘤淋巴结转移,其阳性表达率明显上升(P<0.05);Snail蛋白在鳞癌组织中荧光强度高于正常宫颈组织,浸润癌组织高于宫颈CIN组织(P<0.05),随着组织分化级别下降和肿瘤淋巴结转移,其荧光强度明显增强,但差异亦无统计学意义(P>0.05);E-cadherin在正常宫颈组织中荧光强度高于肿瘤组织,宫颈CIN组织高于浸润癌组织(P<0.05),随着组织分化级别下降和肿瘤淋巴结转移,其荧光强度明显减弱(P<0.05)。结论人宫颈组织上皮-间质转化在宫颈癌侵袭进展中可能发挥重要的作用,同时Snail、Slug信号通路可能参与了宫颈癌的侵袭转移过程。

Slug在调控宫颈鳞状细胞癌上皮-间充质转变中的意义

目的观察宫颈鳞状细胞癌组织中Slug的表达情况,探讨其在宫颈鳞状细胞癌上皮-间充质转变(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)中的作用机制。方法收集临床慢性宫颈炎标本25例、CIN 3级标本33例、宫颈鳞状细胞癌标本98例,分别用免疫组化、Western blot和实时荧光定量PCR检测Slug、E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA的表达情况。结果 Slug和α-SMA在宫颈鳞状细胞癌中高表达,并随恶性程度的升高而加强(P<0.01);E-cadherin在癌组织中的表达降低(P<0.01)。结论 Slug可能通过调控EMT从而在宫颈鳞状细胞癌的侵袭转移过程中发挥作用。

rAAV2-slug-siRNA对原位胰腺癌移植瘤转移和血管生成影响的实验研究

目的:研究slug基因的RNA干扰重组腺病毒载体(rAAV2-slug-siRNA)对原位胰腺癌移植瘤的转移和血管生成的影响。方法:建立胰腺癌细胞株AsPC-1裸鼠原位胰腺癌移植瘤模型,随机分成3组,每组8只,分为空白对照组(腹腔注射生理盐水)、阴性对照组(腹腔注射rAAV2-GFP)、实验组(腹腔注射rAAV2-slug-siRNA)。10周后利用CO2麻醉法处死裸鼠,观察原位胰腺癌移植瘤的重量,抑瘤率,肝、胃肠、腹腔转移,腹水等情况,及肿瘤细胞微血管密度(MVD)。RT-PCR检测移植瘤的slug mR-NA表达,Western blot检测slug蛋白的表达。结果:胰腺癌细胞株AsPC-1裸鼠原位胰腺癌移植瘤模型建立成功,成瘤率100%。实验组原位胰腺癌移植瘤瘤重明显低于阴性对照组(P<0.05),抑瘤率为70.83%。阴性对照组诱发的裸鼠胰腺癌质地硬,肿块向四周浸润并形成癌性粘连,与阴性对照组相比,实验组腹膜、肝、毗邻脏器转移率和形成腹水率均明显下降(P<0.05)。实验组MVD明显少于阴性对照组(P<0.05),slug mRNA相对表达量(RT-PCR)和slug蛋白相对表达量(Western blot)明显低于阴性对照组(P<0.05)。结论:rAAV2-slug-siRNA可能通过抑制肿瘤血管生成而抑制原位胰腺癌移植瘤转移。

RNA干扰下调Slug表达对肺癌细胞A549的细胞周期、增殖和侵袭的影响

目的:应用RNA干扰技术下调肺癌A549细胞中Slug基因的表达,探讨其对A549细胞增殖、细胞周期和细胞侵袭能力的影响。方法:构建靶向Slug基因的shRNA真核表达质粒pGPU6-GFP-Neo-Slug,与阴性对照质粒pNeg-shRNA分别用脂质体法转染A549细胞。Real-time PCR和Western blotting验证转染后Slug mRNA和蛋白的表达。CCK-8法、流式细胞术和Transwell实验分别检测下调Slug表达对A549细胞增殖、细胞周期和侵袭能力的影响。结果:成功构建pGPU6-GFP-NeoSlug载体并转染A549细胞,转染率达90%。与pNeg-shRNA组和空白对照组相比,pSlug-shRNA组A549细胞中Slug mRNA[(0.23±0.01)vs(0.97±0.08)、(1.0±0.09),P<0.05]和蛋白[(0.20±0.09)vs(1.0±0.32)、(1.13±0.26),P<0.05]表达量显著降低;细胞增殖抑制率明显上升[(35.3±5.4)%vs(1.5±0.2)%、(3.3±0.7)%,均P<0.01];细胞增殖指数显著降低[(32.92±0.69)%vs(48.19±0.71)%、(42.88±0.75)%,均P<0.05],并且处于G1期细胞数明显增多[(67.08±0.92)%vs(52.81±0.78)%、(56.12±0.73)%,均P<0.05];细胞侵袭能力显著降低[穿透基底膜细胞数:(55±9)vs(169±12)、(173±15),均P<0.01]。结论:pGPU6-GFP-Neo-Slug转染肺癌A549细胞能有效下调Slug基因的表达,从而抑制A549的增殖侵袭能力、阻滞细胞周期于G1期。

一例重型斑驳病患者的KIT基因突变检测

【目的】对1例斑驳病小家系中的先证者进行致病基因KIT和SLUG(SNAI2)编码序列的突变检测,寻找致病性突变。【方法】应用PCR扩增KIT和SLUG基因编码区及外显子-内含子交界区,对PCR产物进行直接测序。在50例正常对照中进行新突变的测序分析,以排除多态性。【结果】家系先证者SLUG基因检测未发现异常,KIT基因检测到1个国际数据库中尚未报道的点突变c.860T>A(p.V287E),患者父母均未检测到此突变。该突变位于KIT基因编码蛋白的细胞外配体结合区域,第287位的缬氨酸突变为谷氨酸,可能导致了与249位谷氨酸相排斥,破坏了D3结构域中βD和βD/βE稳定性,最终影响SCF(stem cell factor)的结合功能。【结论】KIT基因的新生突变可能是引起本重型斑驳病患者发病的原因。

Slug敲除促进γ-射线照射小鼠肠上皮细胞损伤的体内研究

目的:观察γ射线照射对Slug敲除C57BL/6小鼠肠粘膜上皮细胞损伤的影响及机制。方法:Slug敲除C57BL/6小鼠和非Slug敲除C57BL/6小鼠各12只,以8Gy 60Coγ射线全身一次性照射制作动物模型,分别在照射后第1、3、8天处死小鼠,取小肠组织4%多聚甲醛液固定作病理学检查;取非Slug基因敲除小鼠和Slug基因敲除小鼠各24只,予以8Gy 60Coγ射线全身一次性照射,分别在照射后第2、4和24 h处死,采用免疫组化法检测肠道细胞PUMA表达,TUNEL染色检测细胞凋亡。结果:8Gy 60Coγ射线照射后,Slug基因敲除小鼠死亡率91.67%,明显高于非基因敲除小鼠的25.00%,差异有统计学意义(P=0.004)。Slug敲除小鼠肠道细胞凋亡指数、PUMA阳性表达细胞数以及肠道损伤的严重程度均明显高于非敲除组。结论:Slug基因敲除加重γ射线引起的放射性肠道损伤。

骨肉瘤组织中Slug和E钙粘蛋白的表达意义

目的探讨骨肉瘤组织中Slug和E钙粘蛋白的表达及其意义。方法选取该院2008年1月-2012年6月骨肉瘤标本,用免疫组织化学SP法检测骨肉瘤中Slug和E钙粘蛋白的表达,对结合临床资料进行分析。结果 32例骨肉瘤标本纳入研究,在骨肉瘤组织中Slug和E钙粘蛋白阳性表达率分别为81.3%（26/32）和25.0%（8/32）。结合骨肉瘤临床病理特征的分析发现,Slug、E钙粘蛋白表达与Ennecking外科分期和骨肉瘤转移发生相关,同时还发现骨肉瘤标本中Slug表达与E钙粘蛋白表达为负相关（r=-0.745,P=0.000）。结论 Slug、E钙粘蛋白的表达联合检测可以作为判断骨肉瘤出现转移的指标。