子宫平滑肌细胞SM22-α基因的pEGFP-C3载体构建及siRNA筛选

为研究SM22-α基因在子宫平滑肌中作用机制提供实验基础,通过筛查siRNA有效序列,来构建含SM22-α基因的pEGFP-C3-SM22-α载体.首先构建含有SM22-α基因的pEGFP-C3载体;其次利用FT293细胞并采用Western-bolt检测SM22-α蛋白表达的改变,筛查到siRNA有效序列;得到含SM22-α基因pEGFP-C3-SM22-α载体和干扰SM22-α表达蛋白的siRNA有效片段,成功干扰SM22-α蛋白在子宫平滑肌中的表达.

SM22α在细胞骨架组构及血管重塑中的作用

血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化是动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的共同病理生理过程。VSMC表型转化过程中平滑肌特异基因的表达变化和细胞骨架的组构是当前研究的热点问题之一。平滑肌22α(SM22α)是近年发现的一种VSMC分化标志物,其表达具有平滑肌组织特异性和细胞表型特异性,该蛋白作为一种肌动蛋白细胞骨架相关蛋白参与VSMC骨架组构和收缩调节。本文就SM22α的结构特征及其在VSMC骨架组构和血管重塑中的作用机制进行综述。

SM22α:血管平滑肌细胞分化的分子标志

SM22α是一种分化型血管平滑肌细胞(VSMC)的标志基因,编码一种22 kDa的收缩调节蛋白。由于SM22α基因结构短小,表达具有VSMC特异性、调控机制较为清楚,因而被广泛用于VSMC发育分化的研究。利用该基因的表达调控特征,设计可在VSMC中高表达目的蛋白的人工启动子,是心血管病基因治疗的新策略。

异牛肝菌素通过阻断SM22α泛素化降解抑制血管平滑肌细胞表型转化

从黄乳粘盖牛肝菌(Suillus flavus)中分离得到的异牛肝菌素(iso-suillin)具有显著的抗肿瘤活性,但其在心血管系统的功效尚不明确。本研究用不同浓度的异牛肝菌素预处理原代血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)24 h或48 h后,再采用血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)-BB处理细胞,细胞计数法检测VSMC增殖活性;流式细胞术检测细胞周期分布;Western blot分析检测蛋白表达情况;免疫沉淀检测平滑肌22 alpha(smooth muscle 22 alpha,SM22α)磷酸化和泛素化水平。结果显示,异牛肝菌素显著抑制PDGF-BB引发的VSMC增殖;上调分化标志蛋白SM22α表达,下调增殖相关蛋白PCNA表达;抑制SM22α磷酸化及其泛素化降解,且该过程可能与其阻断蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)δ的活性有关。通过以上结果推测,异牛肝菌素通过抑制PKCδ的活性,降低SM22α磷酸化水平,阻止SM22α泛素化降解,进而抑制VSMC表型转化,发挥血管保护的功能。

重组SM22α C端肽段促进细胞骨架重构

目的:探讨SM22αC端功能域肽段与细胞骨架F-actin聚合的关系,明确SM22α在血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构中的作用。方法:构建GST-SM22αC端功能域融合蛋白原核表达质粒pGEX3X-SM22α,诱导E coli高效表达可溶性GST-SM22α融合蛋白,制备抗SM22α抗体,VSMC蛋白分步提取及Western blot检测F-actin/G-actin中SM22α的含量变化,GST-pull down分析和免疫共沉淀检测SM22α与actin的相互作用,细胞免疫双荧光染色观察SM22α和actin在VSMC中的定位关系。结果:所构建的pGEX3X-SM22α原核表达质粒,在0.5mmol/LIPTG,30℃诱导6h条件下,表达可溶性GST-SM22α融合蛋白的水平最高,用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔获得的抗血清效价为1∶16。免疫双荧光染色和蛋白分步提取分析结果表明,在VSMC再分析过程中,SM22α与F-actin共定位,GSTpull down分析和免疫共沉淀结果均显示,SM22α通过C端功能域与F-actin相互作用而参与细胞骨架的重构;但是,SM22α与G-actin的结合能力较弱。结论:本研究重组得到的SM22αC端功能域具有与F-actin结合的活性,SM22α通过该区域与actin相互作用而参与细胞骨架重构。

哈萨克族食管鳞癌组织中SM22α的表达及其临床意义

目的探讨哈萨克族食管鳞癌组织中SM22α的表达情况及其临床意义。方法用免疫组织化学技术对筛选出的食管鳞癌组织中的差异蛋白SM22α进行验证,并结合临床病理参数对162例石蜡包埋食管鳞癌组织及50例食管黏膜正常组织中SM22α表达情况进行分析。结果SM22α在食管鳞癌组织中的阳性表达率(87.0%)高于食管正常黏膜组织(36.0%),差异有统计学意义(P<0.05);浸润深度(χ~2=8.078,P=0.044)、淋巴结是否转移(χ~2=6.420,P=0.012)与SM22α在食管鳞状细胞癌肿瘤组织中阳性表达存在相关性(P<0.05)。结论 SM22α可能参与了食管鳞状细胞癌的发生、发展。

采用SM22启动子调节荧光蛋白的策略分选和鉴定人前列腺平滑肌细胞与成纤维细胞

平滑肌细胞的数量、表型以及在间质细胞中所占的比例在前列腺间质增生的发生和发展中占有重要的地位.获得纯的平滑肌细胞和成纤维细胞,研究它们基因表达的差异,有助于进一步揭示前列腺增生的分子病因学.构建不同长度的SM22启动子,测定荧光素酶活性.采用了基于启动子特异性激活红绿色荧光蛋白表达结合流式细胞分选的策略,体外分离纯的平滑肌细胞和成纤维细胞.启动子活性实验结果表明,1396bp的人SM22启动子具有平滑肌细胞特异性和较高的相对活性.构建了红绿荧光蛋白的表达载体pDual-color,在此载体中,RFP的表达受1396bp的SM22启动子调控,GFP的组成型表达受CMV启动子控制.用流式细胞仪分选GFP+/RFP+和GFP+/RFP-细胞,提取总RNA,进行实时定量RT-PCR.结果显示,在分选获得的GFP+/RFP+细胞比GFP+/RFP-细胞的SM22和SMMHC表达水平高10倍以上.提示,基于启动子特异性可以在体外分离纯的平滑肌细胞和成纤维细胞.

细胞骨架相关蛋白SM22α与肿瘤

平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)蛋白是一种细胞骨架相关蛋白,其在种属间的高度同源性和进化上的高度保守性提示了其重要的生物学意义。最新研究发现,SM22α在多种肿瘤组织中表达异常,该蛋白除可通过与肌动蛋白相互作用参与细胞骨架重构外,还可作为信号分子参与细胞生长,细胞外基质降解和血管生成。其作为一种新型抑癌基因,在肿瘤发生、发展中的作用日益成为人们关注的焦点。本文就SM22α的结构特征、表达特点及其与肿瘤的关系进行综述。

SM22α、α-SMA、OPN在人胸主动脉夹层中的表达及血管平滑肌细胞表型的变化

目的:探讨平滑肌22α(SM22α)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、骨桥蛋白(OPN)在人胸主动脉夹层中的表达及血管平滑肌细胞(VSMC)表型的变化。方法:收集人胸主动脉夹层(TAD)动脉壁组织和正常人胸主动脉壁组织标本,采用免疫组化方法观察SM22α、α-SMA、OPN的表达。结果:与正常主动脉组相比,TAD组SM22α、α-SMA表达水平显著降低,OPN表达显著增高。结论:TAD主动脉壁VSMC表型由收缩型转变为增殖型为主,从而导致血管壁中膜性状改变,最终导致主动脉夹层病变。

SM22α基因启动子区低甲基化与胃癌发生发展的相关性研究

目的探讨平滑肌蛋白22α(SM22α)基因启动子区甲基化状态及mRNA表达在胃癌发生中的作用,为胃癌早期诊断和治疗寻找新的靶点。方法甲基化特异性聚合酶链反应检测56例胃癌及其对应的正常癌旁组织中SM22α基因启动子区甲基化状态;荧光实时定量PCR技术检测胃癌组织及正常癌旁组织中SM22α基因mRNA的表达。比较胃癌组织和正常癌旁组织中SM22α基因启动子区甲基化状态及mRNA表达的差异情况,并分析它们与胃癌患者临床病理特征之间的关系。结果胃癌组织中SM22α基因启动子区甲基化率显著低于正常癌旁组织(P<0.05),其mRNA表达水平显著高于正常癌旁组织(P<0.05),且甲基化阳性的胃癌组织中SM22α基因mRNA表达量显著低于甲基化阴性的胃癌组织(P<0.05)。胃癌组织中SM22α基因启动子区甲基化状态及、mRNA表达水平与胃癌患者的淋巴结转移呈显著相关(P<0.05)。结论SM22α基因启动子区的低甲基化导致其表达升高可能在胃癌发生、发展中起重要作用,SM22α有可能成为胃癌分子诊断和治疗的重要靶点。

利用RT-PCR检测SM22基因在胃癌及正常组织中表达差异的生物学意义

目的:检测SM22(smoothmuscle22)mRNA在人胃癌及正常组织中的表达水平,探讨SM22基因与胃癌发生的关系,为进一步鉴定胃癌早期诊断筛查的标志物提供理论依据。方法:应用半定量RT-PCR检测42例胃癌组织及14例胃正常组织中SM22mRNA的表达水平并比较其差异。结果:在胃癌组织SM22mRNA的阳性表达率为92.86%(39/42),在正常组织中的阳性表达率为71.43%(10/14),差异无统计学意义(P>0.05)。半定量光密度计数后SM22mRNA表达量在胃癌组织和正常组织中分别为0.86±0.14和0.32±0.22,差异有统计学意义(P<0.01)。在14对胃癌与正常配对标本中,有10对胃癌及正常组织中SM22mRNA均表达阳性而且在肿瘤组织中表达量明显高于正常组织,有4对标本中SM22mRNA只在胃癌组织中表达而在正常组织中表达阴性。结论:SM22mRNA在胃癌组织中的表达量高于正常组织,提示其在胃癌发生发展中可能起一定作用。

miR-342-3p抑制SM22α启动子的转录活性

目的探究miR-342-3p是否通过作用于SM22α启动子,从转录水平调控SM22α的表达。方法通过软件RNAhybrid分析发现,大鼠SM22α启动子中存在一个miR-342-3p的识别位点。将miR-342-3p mimics与报告基因载体p GL3-SM22α-Promoter共转染293A细胞,通过检测荧光素酶活性来分析miR-342-3p对SM22α启动子转录活性的影响。将miR-342-3p mimics转染血管平滑肌细胞,采用q RT-PCR和Western blot分别检测SM22αm RNA和蛋白质水平,分析miR-342-3p对血管平滑肌细胞中SM22α表达的影响。结果与miR-control相比,miR-342-3p能够使SM22α启动子转录活性降低(0.54±0.03)倍,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-control相比,miR-342-3p能够使血管平滑肌细胞中SM22αm RNA水平降低(0.45±0.04)倍,SM22α蛋白质水平下降(0.41±0.05)倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-342-3p通过抑制SM22α启动子活性,从转录水平降低SM22α的表达,为miRNA调控血管平滑肌细胞表型转化研究提供了新角度。

SM22α启动子慢病毒载体的构建及感染研究

目的 构建以SM22α启动子驱动EGFP表达的慢病毒载体,研究此载体在血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）中表达的效率和特异性.方法 从小鼠的基因组中采用PCR扩增SM22α启动子,将目的基因连接至T载体,并进行测序鉴定,将目的基因重组至pGC-FU载体,三质粒系统采用脂质体介导转染293T细胞进行病毒包装,体外感染VSMCs,大鼠动脉内皮细胞,人乳腺癌细胞系SK-BR-3,荧光显微镜观察EGFP的表达情况.结果 PCR扩增得到的SM22α启动子经测序证实正确;成功构建了SM22α启动子驱动EGFP的慢病毒载体LV-SM22α-EGFP,SM22α启动子能调控EGFP在VSMCs中高效表达,感染效率在95%以上,在血管内皮细胞和人乳腺癌细胞系SK-BR-3中不表达,对照慢病毒组EGFP在三种细胞中均表达,在VSMCs的感染效率在30%左右,且表达较低.结论 SM22α启动子能够特异性驱动EGFP在VSMCs中表达,LV-SM22α-EGFP能作为研究血管疾病的良好基因转移载体.

SM22α启动子及增强子应用于冠状动脉旁路移植血管防治再狭窄的效应

背景:大隐静脉是冠状动脉旁路移植术最常用的血管材料,但移植血管新生内膜增生和随后发生的粥样硬化所致的移植血管狭窄严重影响远期疗效。目的:综合分析移植血管狭窄的病理生理及其机制,平滑肌细胞特异性SM22α启动子、SMHC增强子的构建和应用等。方法:以SM22α promoter,SMHC enhancer,stenosis,Pi3k,RNAi/RNA interference为检索词,检索PubMed数据库、HighWire数据库和CNKI数据库(1981-01/2009-10)。文献检索语种限制为英文和中文。纳入与移植血管狭窄,血管平滑肌特异性SM22α启动子及其增强子相关的文献。排除综述文献,重复研究类文献。以血管平滑肌细胞的增殖和凋亡,移植血管新生内膜的增生情况,以及移植血管血栓形成的程度为评价指标。结果与结论:计算机初检得到8730篇文献,根据纳入排除标准,对SM22α启动子及移植血管狭窄进行分析。冠状动脉旁路移植后新生内膜增生和血栓形成严重影响远期疗效。PI3K-Akt-mTOR信号通路是调节细胞增殖、迁移和生存的关键通路。局部shRNA干扰靶向沉默Pik3cb可下调PI3K信号通路,有效防治移植血管新生内膜增生。采用血管平滑肌细胞特异性SM22α启动子构建靶向大鼠Pik3cb基因的干扰RNA真核表达载体,既可抑制新生内膜增生,又可防治血栓的形成。利用血管平滑肌细胞特异性的SM22α基因,将SM22α启动子/增强子应用于移植血管,为防治移植血管狭窄和血栓形成提供新的思路。

SM22α的研究进展

SM22α是分子大小为22kDa的肌动蛋白结合蛋白,是分化型血管平滑肌细胞(VSMC)的标志基因[1],是平滑肌分化的最早标志之一,其基因和蛋白序列在不同物种上高度保守.SM22α功能复杂,合成VSMC中过表达可抑制伪足形成和细胞迁移[2];抑制平滑肌细胞从收缩细胞向合成/增殖细胞的表型调节[3];调节非钙依赖性平滑肌细胞收缩[4];调节肌动蛋白活力,发挥肿瘤抑制作用[5]。因此SM22α在细胞分化、迁移、侵袭和基质重塑中发挥作用[6-7]。笔者探讨其在多种疾病中的作用,以期为临床提供更多理论知识。

组织特异性启动子SM22α逆转录病毒载体的构建和效率

目的克隆小鼠SM22α基因的启动子,检测启动子特异性及效率。方法构建重组慢病毒载体,提纯病毒并感染细胞。结果序列分析表明,PCR扩增片段包含有完整的启动子元件和重要的功能框,成功克隆SM22α启动子。获得含特异SM22α启动子的重组慢病毒,滴度为1×108TU/mL。重组病毒分别感染血管平滑肌细胞(VSMCs)与非血管平滑肌细胞(NSMCs)。与NSMCs相比,在VSMCs中荧光强度明显增高(P<0.05);与巨细胞病毒(CMV)启动子相比,含SM22α启动子的病毒感染效率无明显差异(P>0.05),但诱导绿色荧光蛋白表达强度约为CMV启动子的80%。结论 SM22α启动子具有高度的平滑肌细胞特异性;诱导蛋白表达的能力较强。

雌激素/雌激素受体α信号通路抑制血管平滑肌细胞SM22α的转录作用

目的确定雌激素/雌激素受体α(ERα)信号通路对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)分化标志基因SM22α的转录调节作用。方法利用组织块贴壁法分离获得大鼠VSMCs,采用PCR方法扩增获得大鼠SM22α,并插入到pGL3-Basic质粒中构建SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒。分别在VSMCs和COS-7细胞中利用Lucif-erase检测雌二醇(E2)、ERα及Myocardin对SM22α启动子转录活性的影响情况。结果 SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功,E2、ERα可以抑制Myocardin对SM22α的转录活性。结论 E2/ERα信号通路可通过抑制Myocardin对SM22α的转录活性,从而促进VSMCs由分化型向增殖型转变。

miR-145对血管平滑肌细胞生物活性及SM22αmRNA表达的作用

目的:探究miR-145对血管平滑肌细胞(VSMC)的生物活性及对SM22αmRNA表达的作用。方法:VSMC分为3组,增殖VSMC组(增殖组)、增殖VSMC+转染miR-145-NC组(空载体组)、增殖VSMC+转染miR-145组(增殖转染组)。采用RT-PCR检测VSMC中SM22αmRNA、miR-145的表达;免疫印迹检测cyclin E、p27蛋白水平;Transwell小室检测VSMC侵袭能力;MTT检测VSMC活力;流式细胞术检测VSMC凋亡率。结果:增殖组VSMC中SM22αmRNA、miR-145水平与空载体组相比数值较为接近;与增殖组及空载体组相比,增殖转染组VSMC中miR-145、SM22αmRNA表达升高。增殖组VSMC中cyclin E、p27蛋白水平与空载体组相比无差异;增殖转染组cyclin E蛋白水平低于空载体组、增殖组,p27蛋白水平高于空载体组、增殖组。增殖组VSMC迁移数量与空载体组相比无差异;增殖转染组VSMC迁移数量明显低于空载体组、增殖组。增殖组与空载体组VSMC在不同时间点的OD值均较为接近;增殖转染组OD值在不同时间点均低于空载体组、增殖组。增殖组VSMC凋亡率与空载体组数值接近,组间比较差距较小;增殖转染组VSMC凋亡率较空载体组和增殖组升高。结论:过表达miR-145通过促进SM22α水平增加,抑制血管平滑肌细胞的增殖,并促进其凋亡。

SM22α在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义

目的检测平滑肌22α蛋白(SM22α)在上皮性卵巢癌组织中的表达,探讨其在卵巢癌发生发展中的作用及意义。方法选取2015年12月至2018年12月石家庄市第一医院妇科手术治疗的上皮性卵巢癌患者卵巢癌组织标本43例为试验组,选取同期因宫颈癌或子宫肌瘤行全子宫双附件切除患者的正常卵巢组织50例为对照组。荧光实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测2组标本SM22α基因mRNA的表达情况,Western blot检测2组标本SM22α蛋白表达情况,并分析SM22α基因mRNA及蛋白表达与卵巢癌患者临床病理特征之间的关系。结果卵巢癌组织中SM22αmRNA及其蛋白表达水平显著低于正常卵巢组织(P<0.05),且卵巢癌组织中SM22αmRNA表达水平与其蛋白表达呈正相关性(r=0.701,P<0.05)。此外,卵巢癌组织中SM22αmRNA及其蛋白表达水平表达与卵巢癌患者的淋巴结转移有相关性(P<0.05)。结论SM22α表达下调可能在卵巢癌发生、发展过程中发挥重要作用,其有可能成为卵巢癌分子诊断和治疗的重要靶点。

SM22α基因启动子区高甲基化与卵巢癌发生发展的相关性研究

目的检测上皮性卵巢癌组织中平滑肌蛋白22α(SM22α)基因启动子区甲基化状态及SM22α基因mRNA的表达情况,探讨其在卵巢癌发生发展中的作用。方法收集2015年12月至2019年10月住院手术治疗上皮性卵巢癌患者的卵巢癌组织标本51例为实验组,对照组收集同期55例因宫颈上皮内瘤变III级或宫颈癌行全子宫双附件切除的正常卵巢组织。应用甲基化特异性聚合酶链反应检测两组标本SM22α基因启动子区甲基化状态,qRT-PCR方法检测两组SM22αmRNA表达。结果卵巢癌组织中SM22α基因启动子区甲基化在卵巢癌组织中的阳性率显著高于正常卵巢组织(P<0.05),SM22α基因mRNA表达水平显著低于正常卵巢组织(P<0.05),且SM22α基因甲基化阳性的卵巢癌组织中SM22α的mRNA表达水平显著低于其在甲基化阴性组织中的表达(P<0.05)。此外,SM22α的甲基化状态及表达与卵巢癌患者淋巴结转移、FIGO分期有显著相关关系(P<0.05)。结论SM22α基因启动子区高甲基化状态导致SM22α表达下调可能促进卵巢癌的发生发展,SM22α有望成为卵巢癌诊断和治疗的分子靶点。