SM22α启动子及增强子应用于冠状动脉旁路移植血管防治再狭窄的效应

背景:大隐静脉是冠状动脉旁路移植术最常用的血管材料,但移植血管新生内膜增生和随后发生的粥样硬化所致的移植血管狭窄严重影响远期疗效。目的:综合分析移植血管狭窄的病理生理及其机制,平滑肌细胞特异性SM22α启动子、SMHC增强子的构建和应用等。方法:以SM22α promoter,SMHC enhancer,stenosis,Pi3k,RNAi/RNA interference为检索词,检索PubMed数据库、HighWire数据库和CNKI数据库(1981-01/2009-10)。文献检索语种限制为英文和中文。纳入与移植血管狭窄,血管平滑肌特异性SM22α启动子及其增强子相关的文献。排除综述文献,重复研究类文献。以血管平滑肌细胞的增殖和凋亡,移植血管新生内膜的增生情况,以及移植血管血栓形成的程度为评价指标。结果与结论:计算机初检得到8730篇文献,根据纳入排除标准,对SM22α启动子及移植血管狭窄进行分析。冠状动脉旁路移植后新生内膜增生和血栓形成严重影响远期疗效。PI3K-Akt-mTOR信号通路是调节细胞增殖、迁移和生存的关键通路。局部shRNA干扰靶向沉默Pik3cb可下调PI3K信号通路,有效防治移植血管新生内膜增生。采用血管平滑肌细胞特异性SM22α启动子构建靶向大鼠Pik3cb基因的干扰RNA真核表达载体,既可抑制新生内膜增生,又可防治血栓的形成。利用血管平滑肌细胞特异性的SM22α基因,将SM22α启动子/增强子应用于移植血管,为防治移植血管狭窄和血栓形成提供新的思路。

采用SM22启动子调节荧光蛋白的策略分选和鉴定人前列腺平滑肌细胞与成纤维细胞

平滑肌细胞的数量、表型以及在间质细胞中所占的比例在前列腺间质增生的发生和发展中占有重要的地位.获得纯的平滑肌细胞和成纤维细胞,研究它们基因表达的差异,有助于进一步揭示前列腺增生的分子病因学.构建不同长度的SM22启动子,测定荧光素酶活性.采用了基于启动子特异性激活红绿色荧光蛋白表达结合流式细胞分选的策略,体外分离纯的平滑肌细胞和成纤维细胞.启动子活性实验结果表明,1396bp的人SM22启动子具有平滑肌细胞特异性和较高的相对活性.构建了红绿荧光蛋白的表达载体pDual-color,在此载体中,RFP的表达受1396bp的SM22启动子调控,GFP的组成型表达受CMV启动子控制.用流式细胞仪分选GFP+/RFP+和GFP+/RFP-细胞,提取总RNA,进行实时定量RT-PCR.结果显示,在分选获得的GFP+/RFP+细胞比GFP+/RFP-细胞的SM22和SMMHC表达水平高10倍以上.提示,基于启动子特异性可以在体外分离纯的平滑肌细胞和成纤维细胞.

miR-342-3p抑制SM22α启动子的转录活性

目的探究miR-342-3p是否通过作用于SM22α启动子,从转录水平调控SM22α的表达。方法通过软件RNAhybrid分析发现,大鼠SM22α启动子中存在一个miR-342-3p的识别位点。将miR-342-3p mimics与报告基因载体p GL3-SM22α-Promoter共转染293A细胞,通过检测荧光素酶活性来分析miR-342-3p对SM22α启动子转录活性的影响。将miR-342-3p mimics转染血管平滑肌细胞,采用q RT-PCR和Western blot分别检测SM22αm RNA和蛋白质水平,分析miR-342-3p对血管平滑肌细胞中SM22α表达的影响。结果与miR-control相比,miR-342-3p能够使SM22α启动子转录活性降低(0.54±0.03)倍,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-control相比,miR-342-3p能够使血管平滑肌细胞中SM22αm RNA水平降低(0.45±0.04)倍,SM22α蛋白质水平下降(0.41±0.05)倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-342-3p通过抑制SM22α启动子活性,从转录水平降低SM22α的表达,为miRNA调控血管平滑肌细胞表型转化研究提供了新角度。

SM22α启动子慢病毒载体的构建及感染研究

目的 构建以SM22α启动子驱动EGFP表达的慢病毒载体,研究此载体在血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）中表达的效率和特异性.方法 从小鼠的基因组中采用PCR扩增SM22α启动子,将目的基因连接至T载体,并进行测序鉴定,将目的基因重组至pGC-FU载体,三质粒系统采用脂质体介导转染293T细胞进行病毒包装,体外感染VSMCs,大鼠动脉内皮细胞,人乳腺癌细胞系SK-BR-3,荧光显微镜观察EGFP的表达情况.结果 PCR扩增得到的SM22α启动子经测序证实正确;成功构建了SM22α启动子驱动EGFP的慢病毒载体LV-SM22α-EGFP,SM22α启动子能调控EGFP在VSMCs中高效表达,感染效率在95%以上,在血管内皮细胞和人乳腺癌细胞系SK-BR-3中不表达,对照慢病毒组EGFP在三种细胞中均表达,在VSMCs的感染效率在30%左右,且表达较低.结论 SM22α启动子能够特异性驱动EGFP在VSMCs中表达,LV-SM22α-EGFP能作为研究血管疾病的良好基因转移载体.

组织特异性启动子SM22α逆转录病毒载体的构建和效率

目的克隆小鼠SM22α基因的启动子,检测启动子特异性及效率。方法构建重组慢病毒载体,提纯病毒并感染细胞。结果序列分析表明,PCR扩增片段包含有完整的启动子元件和重要的功能框,成功克隆SM22α启动子。获得含特异SM22α启动子的重组慢病毒,滴度为1×108TU/mL。重组病毒分别感染血管平滑肌细胞(VSMCs)与非血管平滑肌细胞(NSMCs)。与NSMCs相比,在VSMCs中荧光强度明显增高(P<0.05);与巨细胞病毒(CMV)启动子相比,含SM22α启动子的病毒感染效率无明显差异(P>0.05),但诱导绿色荧光蛋白表达强度约为CMV启动子的80%。结论 SM22α启动子具有高度的平滑肌细胞特异性;诱导蛋白表达的能力较强。

平滑肌22α启动子/增强子靶向调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路对移植血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 采用血管平滑肌细胞（SM）特异性SM22α启动子/平滑肌肌球重链蛋白（SMHC）增强子,构建靶向大鼠哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因的干扰RNA真核表达载体,研究其对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖及移植血管新生内膜增生的影响.方法 构建大鼠特异性SM22α真核表达载体SM22α-p/e-mTOR-短发卡RNA（shRNA）,建立大鼠颈静脉-动脉移植模型,在血管吻合完成后通过Pluronic F-127质粒缓释系统对血管内平滑肌增殖进行局部RNA干扰.实验分5组,每组20只SD大鼠.A组：对照组（25％ Pluronic F-127组）;B组：SM22α组（SM22α-p/e-mTOR-shRNA）;C组：巨细胞病毒（CMV）组（CMV-p/e-mTOR-shRNA）;D组：阴性对照组（空质粒pGenesil-10）;E组：阳性对照组;其中,B组和C组统称实验组.根据实验分组的不同,将含有50 μg shRNA质粒,或50 μg渥曼青霉素（wortmannin）凝胶,或单纯200μl 25％ Pluronic F-127凝胶均匀涂抹在移植静脉周围,分别于术后1、3、7、14 d获取移植血管.苏木素-伊红（HE）染色观察新生内膜厚度;免疫组织化学检测平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）、增殖细胞核抗原（PCNA）、磷酸化-mTOR （Ser2448）,原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测细胞凋亡,评估mTOR信号通路的变化以及平滑肌细胞的增殖.结果 术后7d各组新生内膜厚度差异有统计学意义（P＜0.05）;术后14 d,A组新生内膜较术后1d增厚12.4倍;B、C、D、E组分别增厚9.7、4.8、7.6、2.6倍.术后14d,各实验组和阳性对照组移植静脉α-SM-actin表达阳性面积均明显低于对照组（P＜0.05）,PCNA阳性表达面积均低于对照组（P＜0.05）,磷酸化-mTOR（Ser2448）阳性表达面积均低于对照组（P＜0.05）;实验组、对照组、阴性对照组术后移植静脉凋亡细胞阳性面积比较差异无统计学意义（P＞0.05）,阳性对照组凋亡面积明显高于其他组（P＜0.05）.结论 SM22α-p/e-mTOR-shRNA可通过抑制血管平滑肌细胞mTOR信号通路而抑制血管平滑肌细胞增殖,预防或延缓移植静脉狭窄.

SM22α启动子／增强子基因调控磷酸肌醇3激酶信号通路对移植血管新生内膜增生的影响

目的采用组织特异性启动子SM22α，构建靶向大鼠磷脂酰肌醇3激酶β亚单位（Pik3cb）的短发仁RNA（shRNA）真核表达载体，观察其对静脉移植血管血栓形成和新生内膜增生的影响。方法建立大鼠颈静脉-动脉移植模型，通过Pluronic F-127质粒缓释系统在血管吻合完成后局部喷涂凝胶进行RNA干扰。实验分4组，每组30只SD大鼠，A组：对照组，空白Pluronic F-127凝胶；B组：SM22a组，含特异性SM22a启动子质粒的凝胶；C组：巨细胞病毒（CMV）组，含非特异性CMV启动子质粒的凝胶；D组：Wortmannin阳性对照组。分别于术后1、3、7、14、28d截取移植血管，苏木素-伊红（HE）染色观察新生内膜厚度；免疫组织化学检测磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR，Ser2448），原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测细胞凋亡。另设一平行实验组（12只SD大鼠），按上述方法分为4组，于术后3d取材，实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（VQ—PCR）测定Pik3cb mRNA的相对表达量。结果大体观察移植血管通畅率B组最高（86．7％），与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）；Pik3cb mRNA相对表达量B、C、D组分别下降了73．3％、81．2％、68．4％，与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）；术后1、3、7、14、28d，B组与A组比较，磷酸化mTOR（Ser2448）阳性面积均显著降低，细胞凋亡阳性面积均显著增加，差异均有统计学意义（P〈0．05），术后7、14、28d，B组与A组比较，血管内膜厚度显著降低，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论SM22α特异性启动子／增强子真核表达载体可通过下调血管平滑肌细胞磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B—mTOR（P13K—Akt—mTOR）信号通路而抑制其向内膜增殖、迁移，促进其凋亡，防止血管新生内膜增生，提高移植血管通畅率。

SM22启动SCAP真核表达质粒的构建及其在CHO细胞中的表达

为建立平滑肌特异的固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的裂解激活蛋白(SCAP)超表达的转基因小鼠,深入探讨SCAP的功能,本实验构建了由平滑肌特异蛋白SM22启动子(pSM22)启动仓鼠SCAP443位点突变体——SCAP(D443N)的真核表达质粒,并在仓鼠卵巢细胞(CHO)验证其表达。利用巢式PCR从小鼠肝脏组织提取的基因组中扩增得到pSM22基因。先将其插入pMD-T载体,构建T-SM22,对pSM22测序后,通过双酶切将pSM22克隆到pGL3-control-Luc中,成为pGL3-SM22-Luc。转染pGL3-SM22-Luc到血管平滑肌(VSMCs)中,通过检测荧光素酶(Luc)值观察pSM22在VSMCs内的启动活性。利用PCR从pTK-HSV-SCAP(D443N)质粒中扩增出SCAP(D443N)后克隆入pGL3-control中,成为pGL3-SCAP。然后再将pSM22克隆入pGL3-SCAP中,成为表达质粒pGL3-SM22-SCAP(D443N)。转染表达质粒到CHO细胞,用real-timePCR和Western blotting验证SCAP(D443N)的表达。结果证实pSM22在体外VSMCs中能启动Luc的表达;表达质粒pGL3-SM22-SCAP(D443N)酶切及测序结果正确;将其转染到CHO细胞后,与转染pGL3-control的对照细胞相比SCAP(D443)mRNA和蛋白表达显著增强。

靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)基因的短发卡干扰RNA(shorthair-pinRNA,shRNA)表达载体,研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用,探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段。方法根据Genbank中大鼠PI3Kp110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10,经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板;合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列,将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cb-shRNA上,构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22αp-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA(简称SM22αe/pshRNA)和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA(简称KDRe/pshRNA);将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞,分别于转染24h、48h、72h后,采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量。结果荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较,前者细胞Pik3cbmRNA相对表达量降低更为明显,且两组均较对照组mRNA表达明显减少(P<0.05);酶切鉴定重组质粒载体SM22αe/pshRNA和KDRe/pshRNA构建成功;质粒转染细胞后,Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22αe/p质粒组较阴性对照组均有所降低,且转染24h后,SM22αe/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板,能够成功构建SM22αe/pshRNA和KDRe/pshRNA质粒载体,且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达。