Smad泛素化调节因子2siRNA的筛选及转染原代肾小管上皮细胞条件的优化

试验旨在优化Smad泛素化调节因子2（Smurf2） siRNA最佳转染条件，筛选最佳siRNA干扰片段，进而实现对Smurf2基因的瞬时沉默，为研究Smurf2基因在马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephrohathy，AAN）中的作用奠定基础。本研究通过培养小鼠原代肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells，RTECs），并以脂质体LipofectamineTM 2000为转染介质，将Smurf2 siRNA转染入RTECs；通过观察绿色荧光的表达量及Real-time PCR反应优化转染条件，转染后Real-time PCR检测mRNA表达抑制率。CCK-8法检测Smurf2 siRNA复合物对RTECs活性的影响；同时，用Real-time PCR和Western blotting检测不同位点Smurf2 siRNA对Smurf2 表达的影响。结果显示,当Lipofectamine TM 2000与siRNA比例为1.5 μL∶30 pmol时，转染效率最高，为70%～80%；Smurf2-619 siRNA干扰效果最明显；与正常组相比，转染siRNA组的Smurf2蛋白表达水平显著下降（P〈0.05）。最终确定了Smurf2 siRNA最佳转染条件，其中Smurf2-619 siRNA对Smurf2 表达的抑制率最高。

Smad泛素化调节因子2对人胚胎眼巩膜成纤维细胞TGF-β1/Smads信号通路和I型胶原表达的影响

目的探讨Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导后对人胚胎眼巩膜成纤维细胞(HFSFs)分泌Smads蛋白、I型胶原α1(COLIA1)的影响,探讨泛素化在巩膜重塑中的作用。方法HFSFs复苏并稳定传代后,免疫组化(IHC)法检测细胞中Smurf2的表达。将HFSFs细胞分别设空白对照组、TGF-β1组(加入10 ng/mL TGF-β1)、Control siRNA转染组(10 ng/mL TGF-β1+Control siRNA)及Smurf2 siRNA转染组(10ng/mL TGF-β1+Smurf2 siRNA)。Western Blot法检测COLIA1蛋白表达水平。RT-PCR法检测各组细胞中Smurf2、Smad2、Smad3和Smad7的mRNA表达水平。结果IHC结果显示,HFSFs中有Smurf2蛋白表达。TGF-β1诱导HFSFs中COLIA1蛋白显著性高表达,而当Smurf2被抑制时,COLIA1蛋白表达受抑制。与空白对照组比较,Smad7 mRNA表达水平呈上升趋势,差异有统计意义(P<0.05),但Smad7蛋白表达水平与PCR结果不完全相同;各培养组中Smad2和Smad3 mRNA和蛋白表达水平,与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论Smurf2表达于HFSFs细胞中,且随着Smurf2表达减少,HFSFs细胞中Smad7蛋白含量呈上升趋势,COLIA1含量呈下降趋势。提示Smurf2可能通过作用于TGF-β1/Smads信号通路参与了巩膜重塑过程。

Smad泛素化调节因子和Arkadia在大鼠肺纤维化中的作用研究

目的探讨Smad泛素化调节因子(Smurf)和Arkadia在博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化形成中的作用及可能的分子机制。方法将24只无特定病原体级健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型7 d组、模型14 d组、模型28 d组,每组6只。模型组大鼠气管内滴入博莱霉素(10 mg/kg)建立肺纤维化动物模型,对照组气管内滴入等体积0.9%氯化钠注射液。于造模后第7、14和28天分批处死大鼠。应用苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色观察肺组织炎症及纤维化情况;应用逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测Ⅰ型胶原α1(COL1A1)、Arkadia、Smurf1、Smurf2、Smad7、Ski和转化生长因子βⅠ型受体(TβRⅠ)的表达。结果 HE染色和Masson染色显示肺纤维化模型建立成功。模型7、14、28d组大鼠肺组织COL1A1蛋白表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型7、14、28 d组大鼠肺组织Arkadia mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组,Smurf2 mRNA和蛋白表达水平均明显低于对照组(均P<0.05)。模型7 d组大鼠肺组织Smad7和Ski蛋白表达水平明显高于对照组,随后Smad7和Ski蛋白表达水平随时间延长而逐渐降低,至第28天均低于对照组水平(均P <0.05),但各组间Smad7和Ski mRNA表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。模型7、14、28 d组大鼠肺组织TβRⅠmRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组[(0.340±0.056)、(0.520±0.021)、(1.014±0. 190)比(0.244±0.033);(0.453±0. 033)、(0.617±0. 060)、(0. 720±0. 038)比(0.309±0.031)],差异均有统计学意义(均P <0. 05)。结论 Smurf2和Arkadia均参与了博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化形成;Arkadia可能通过泛素化降解蛋白途径实现对Smad7和Ski蛋白表达的下调,促进肺纤维化形成。

Smad泛素化调节因子与组织修复及器官纤维化的研究进展

泛素(ubiquitin)因其在整个生物界广泛存在而得名。泛素依赖性的蛋白质降解系统通过降解缺陷无用的蛋白质和失活的各种细胞器,影响着机体的染色体结构与功能、遗传信息的复制与表达、细胞信号传导与调节等常见生命现象。转化生长因子β(transforming growth factor β)及TGF-β/Smad信号传导通路在组织修复及器官纤维化过程中起重要作用。TGF-β/Smad信号传导调节机制复杂,其中探讨TGF-β/Smad信号传导通路的终止机制是近年研究热点。随着泛素-蛋白水解酶复合体可阻断TGFB/Smad信号分子作用的发现,一类特异性介导Smads泛素化降解的关键泛素酶—Smads泛素化调节因子(Smad ubiquitination regulatoryfactors,Smurfs)逐渐为学者所重视。本文对Smurfs与组织修复、纤维化过程中的生理及病理研究进展作如下综述。

转化生长因子β_1对人巩膜成纤维细胞Smad泛素化调节因子2和Ⅰ型胶原α_1影响的研究

目的探讨Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在人胚胎眼巩膜成纤维细胞(HFSFs)中的表达,检测转化生长因子β_1(TGF-β_1)影响下HFSFs中Smurf2和Ⅰ型胶原α_1(COLIA1)含量的变化。方法 HFSFs复苏并稳定传代后,用免疫细胞化学法检测细胞中Smurf2的表达。分别用不同浓度的TGF-β_1(0、1 ng/ml、5 ng/ml及10 ng/ml)处理HFSFs 24 h以及10 ng/ml TGF-β_1处理HFSFs不同时长(1 h、6 h、12 h及24 h)后,用实时荧光定量法检测各组Smurf2信使核糖核酸(mRNA)和COLIA1 mRNA表达水平。数据以均数±标准差(±s)描述,不同浓度和不同时长的组间比较采用单因素方差分析,当差异有统计学意义时,进一步采用SNK法两两比较。结果免疫细胞化学检测的结果显示,HFSFs中有COLIA1 mRNA和Smurf2蛋白的表达。与空白对照组比较,TGF-β_110 ng/ml组COLIA1 mRNA的表达呈上升趋势(F=3. 17,P <0. 05),TGF-β_15 ng/ml、10 ng/ml组Smurf2 mRNA表达上调(F=2. 35,2. 00; P <0. 05)。10 ng/ml TGF-β_1干预HFSFs培养1 h、6 h、12 h及24 h后,24 h组COLIA1 mRNA表达显著升高(F=29. 20,P <0. 05)。Smurf2 mRNA表达改变呈先上升后下降趋势,在6 h达到最高(F=10. 65,P <0. 05)。结论 TGF-β_1可能通过调控HFSFs Smurf2的表达,诱导HFSFs COLIA1的合成。

Smad泛素化调节因子2在肝纤维化过程中对结缔组织生长因子的作用研究

目的:在体内和体外研究Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在肝纤维化过程中对结缔组织生长因子(CTGF)的作用。方法:建立四氯化碳诱导肝纤维化大鼠模型,收集人类肝硬化和正常肝组织样本,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹(Western blot,WB)、免疫组织化学(IHC)方法检测Smurf2和CTGF的表达;培养人类肝星状细胞(LX-2),构建Smurf2表达质粒和小干扰RNA(siRNA),在转化生长因子β1(TGF-β1)作用后,通过WB检测Smurf2过表达和小干扰后对CTGF表达的影响。结果:在大鼠肝纤维化时,Smurf2表达增加,伴有CTGF水平增高;大鼠和人类肝硬化组织中,Smurf2表达反而减少,CTGF表达仍然增加。体外肝星状细胞用TGF-β1处理后,CTGF蛋白水平升高;过表达Smurf2可以阻断CTGF蛋白的合成;抑制Smurf2表达后,CTGF表达持续增加。TGF-β1处理LX-2后可以诱导Smurf2表达内源性轻度增加。结论:Smurf2可以由TGF-β1诱导产生,作为负反馈抑制子抑制肝纤维化过程中CTGF表达的增加。

NF-κB对Smad泛素化调节因子1表达水平的调节作用

目的鉴定Smad泛素化调节因子1（Smad ubiquitination regulatory factor 1，SMURFl）基因启动子区的一个核因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）反应元件，并探讨后者对于SMURFl表达的调节作用。方法构建系列截短的SMURFl基因启动子荧光素酶报告基因载体，转染肝癌HepG2细胞，检测荧光素酶的活性，分析各段启动子的活性。应用DNA结合实验和染色质免疫沉淀实验鉴定SMURF1基因启动子区的NF-κB反应元件；构建NF-κB位点突变的荧光素酶报告基因载体并检测其活性；转染NF-xB特异性小干扰RNA，检测SMURF1表达水平的变化。结果SMURFl基因的各段启动子具有高转录活性，其中-519～-378区域为一个正调控区；SMURF1启动子-411--420区域为NF-κB反应元件，NF—κB特异性结合于该位点；该元件突变可使SMURF1启动子活性明显下降；转染NF-κB特异性小干扰RNA可下调SMURn的表达水平。结论NF-KB特异性结合于SMURF1启动子-411--420区，对SMURFl的表达水平具有重要的调节作用。

Smad泛素化调节因子1与胃腺癌发生相关性研究

【目的】探讨Smad泛素化调节因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1,SMURF1)在胃腺癌中的表达水平,从而证明其在胃腺癌发生中的可能作用。【方法】以相应癌旁正常组织为对照,应用实时定量聚合酶链式反应方法和Western blotting印迹杂交方法检测101例胃腺癌组织中SMURF1 mRNA和蛋白表达水平,并应用统计学方法比较组间差异。【结果】肿瘤组SMURF1 mRNA表达水平均值为0.921±0.293,癌旁组织均值为0.611±0.251,在检测的101例标本中,肿瘤组织SMURF1mRNA水平高于相应癌旁组织的有71例,占70%;肿瘤组SMURF1蛋白表达均值为0.665±0.223,癌旁组织为0.416±0.203,肿瘤组织SMURF1蛋白表达高于相应癌旁组织的有78例,占77%。经统计分析,SMURF1 mRNA与蛋白表达水平肿瘤组与对照组组间差异均显著(P<0.05)。【结论】胃腺癌中SMURF1表达水平升高,其可能在胃腺癌的发生中发挥一定作用。

MG132对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞Smad泛素化调节因子2和Smad7的影响

近来发现在肾纤维化模型（UUO）中Smad泛素化调节因子2（Smad ubiquitin regulatory factor2，Smurf2）表达增强，Smad7蛋白表达明显降低，Smurf2能通过泛素蛋白酶体途径增加Smad7降解。Smad7是TGF-β信号转导途径中的主要抑制性调控蛋白，因此阻断Smurf2的表达，有可能会起到抗纤维化的作用。MG132是一种有效、可逆的醛基肽类特异性蛋白酶体抑制剂，能阻断泛素蛋白酶体通路。我们主要研究MG132对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞（HKC）表达Smurf2、Smad7及Ⅳ型胶原的影响，为肾纤维化的防治寻找新的靶点。

沉默Smad泛素化调节因子2基因对人增生性瘢痕成纤维细胞功能的影响

目的探讨沉默Smad泛素化调节因子2（Smurf2）基因对人增生性瘢痕Fb分泌TGF－β1、α平滑肌肌动蛋白（α－SMA）、Ⅰ型胶原的影响。 方法取9例烧伤后增生性瘢痕患者的正常皮肤组织和瘢痕组织，用组织块法培养人正常皮肤Fb和增生性瘢痕Fb，将2种第3代Fb均按随机数字表法分成6组，每组9孔。空白对照组，不加任何小干扰RNA培养72 h；阴性对照组，转染非靶向的小干扰RNA培养72 h；Smurf2小干扰RNA转染组，转染100 nmol/L的Smurf2小干扰RNA培养72 h；空白对照＋TGF－β1组，不加任何小干扰RNA培养72 h后加入10 ng/mL TGF－β1刺激6 h；阴性对照＋TGF－β1组，转染非靶向的小干扰RNA培养72 h后加入10 ng/mL TGF－β1刺激6 h；Smurf2小干扰RNA转染＋TGF－β1组，转染Smurf2小干扰RNA培养72 h后加入10 ng/mL TGF－β1刺激6 h。（1）分别采用蛋白质印迹法、RT－PCR法检测2种细胞空白对照组、阴性对照组、Smurf2小干扰RNA转染组Smurf2的蛋白和mRNA表达。（2）采用ELISA法检测2种细胞空白对照组和Smurf2小干扰RNA转染组细胞培养上清液中TGF－β1含量。（3）采用蛋白质印迹法检测2种细胞6组α－SMA的蛋白表达，ELISA法检测2种细胞6组细胞培养上清液中Ⅰ型胶原含量。（4）采用RT－PCR法检测2种细胞6组α－SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达。以上实验中各组样本数均为9。对数据行析因设计方差分析、Bonferroni法检验。 结果（1）2种细胞Smurf2小干扰RNA转染组中Smurf2的蛋白和mRNA表达量均明显低于空白对照组和阴性对照组（P值均小于0.05），空白对照组和阴性对照组中Smurf2的蛋白和mRNA表达量均相近（P值均大于0.05）。（2）增生性瘢痕Fb空白对照组和Smurf2小干扰RNA转染组细胞培养上清液中TGF－β1含量分别为（4.34±0.56）、（2.14±0.28）pg/mL，均明显高于正常皮肤Fb的（1.52±0.20）、（1.41±0.18）pg/mL（P值均小于0.05）。增生性瘢痕Fb中，Smurf2小干扰RNA转染组细胞培养上清液中TGF－β1含量明显低于空白对照组（P〈0.05）；正常皮肤Fb中，Smurf2小干扰RNA转染组细胞培养上清液中TGF－β1含量与空白对照组相近（P〉0.05）。（3）2种细胞空白对照＋TGF－β1组α－SMA蛋白表达量和细胞培养上清液中Ⅰ型胶原含量均明显高于空白对照组（P值均小于0.05），阴性对照＋TGF－β1组α－SMA蛋白表达量和细胞培养上清液中Ⅰ型胶原含量均明显高于阴性对照组（P值均小于0.05），Smurf2小干扰RNA转染组α－SMA蛋白表达量和细胞培养上清液中Ⅰ型胶原含量均与空白对照组和阴性对照组相近（P值均大于0.05），Smurf2小干扰RNA转染＋TGF－β1组α－SMA蛋白表达量和细胞培养上清液中Ⅰ型胶原含量均明显低于空白对照＋TGF－β1组和阴性对照＋TGF－β1组（P值均小于0.05）。（4）2种细胞空白对照＋TGF－β1组α－SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达量均明显高于空白对照组（P值均小于0.05），阴性对照＋TGF－β1组α－SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达量均明显高于阴性对照组（P值均小于0.05），Smurf2小干扰RNA转染组α－SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达量均与空白对照组和阴性对照组相近（P值均大于0.05），Smurf2小干扰RNA转染＋TGF－β1组α－SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达量均明显低于空白对照＋TGF－β1组和阴性对照＋TGF－β1组（P值均小于0.05）。 结论沉默人增生性瘢痕Fb中Smurf2基因，可减少TGF－β1的自分泌及抑制TGF－β1诱导的α－SMA表达和Ⅰ型胶原合成。

TGF-β1/Smads信号通路在SIRT1抗心肌纤维化中的作用及机制研究

目的 观察沉默信息调节因子1(sirtuin 1,SIRT1)对压力超负荷致大鼠心肌纤维化及血管紧张素Ⅱ(angiotensin, AngⅡ)诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响,并探讨其分子机制。方法 在体实验通过不完全结扎大鼠腹主动脉,使压力负荷增加诱导心肌纤维化,给予SIRT1激活剂后,左室心肌组织行Masson染色,观察心肌间质纤维化并计算胶原容积分数,免疫组化染色检测心肌组织TGF-β1/Smads蛋白表达。提取新生大鼠心脏成纤维细胞,给予AngⅡ或AngⅡ加SIRT1激活剂后,采用MTT法检测细胞增殖,qRT-PCR和Western blot法检测心肌组织及成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原(collagenⅠ/Ⅲ,Col1α1/3α1)、SIRT1及TGF-β1/Smads mRNA及蛋白的表达。结果 与假手术组相比,压力超负荷模型组大鼠心肌间质出现显著的纤维化,心肌胶原容积分数增加,Col1α1/3α1、TGF-β1/Smads表达明显增多,SIRT1表达减少;给予SIRT1激活剂SRT1720干预后可改善压力超负荷诱导的心肌间质纤维化,下调Col1α1/3α1、TGF-β1/Smads表达,上调SIRT1的表达;同时,相关性分析显示SIRT1的蛋白表达与TGF-β1的表达呈负相关。另外,SRT1720亦可抑制AngⅡ诱导的成纤维细胞增殖、Col1α1/3α1及TGF-β1表达的增加。结论 激活SIRT1对压力超负荷导致的心肌纤维化及AngⅡ诱导的成纤维细胞增殖均有显著的抑制作用,其可能通过调节TGF-β1/Smads信号通路抑制或逆转心肌纤维化的发生。

泛素化调节因子2真核表达质粒的构建及其在原代肾小管上皮细胞的表达

本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mR-NA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。

干扰素调节因子4在风湿性心脏病中去泛素化作用的研究

目的探究风湿性心脏病病人干扰素调节因子4(IRF4)去泛素化与去泛素化酶USP4互相作用的分子机制,为风湿性心脏病提供新的治疗策略。方法来自安徽医科大学第一附属医院2015年7月至2016年1月20例风湿性心脏病病人,均行体外循环下瓣膜置换手术,均顺利出院。10例健康对照来自于健康志愿者。分别抽取以上参与实验人员5 mL的外周血,经过细胞培养与转染;通过免疫共沉淀实验观察IRF4的DNA结合结构域以及和配体结合结构域是否可以和USP4互相结合;通过NI-NTA镍螯合树脂纯化实验观察IRF4蛋白针对48位和63位赖氨酸相关的去泛素化是否可以被USP4介导;应用荧光素酶检测技术观察白细胞介素(IL)-4是否可以在IRF4、活化T细胞核因子(NFATC2)和USP4共同促进下表达;利用基因沉默方法在人源Th2细胞中下调USP4。结果下调USP4后Th2细胞相关细胞因子的转录水平也明显减少;利用流式细胞术检测经USP4抑制剂处理后的Th2细胞表达的IRF4和IL-4均减少;以流式细胞技术测得风湿性心脏病中IL-4表达增高,IRF4表达也增高。结论风湿性心脏病病人血中IRF4的蛋白稳定表达可以通过USP4去泛素化的作用而实现;IL-4在IRF4表达增加协同NFATC2的情况下可增加表达。

Smad泛素化调控因子阳性表达对非小细胞肺癌手术患者生存预后的影响

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最为常见的一种恶性肿瘤,NSCLC约占肺癌的85%,且具有多期进展、远处转移和高死亡率等特点。晚期NSCLC的治疗效果较差,5年生存率低于15%^([1])。因此,寻找生物标志物来预测NSCLC患者的预后并指导治疗至关重要。Smad泛素化调控因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1,Smurf1)包含一个WW域、C2域和HECT域,是一个与E6AP羧基末端(HECT)E3泛素连接酶同源^([2])。

扶正化瘀方影响转化生长因子β1/Smad信号通路的抗肝纤维化作用机制

目的:探讨扶正化瘀方影响转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad信号转导的抗肝纤维化作用机制。方法:本研究分体内实验和体外实验两部分。在体内实验中,37只雄性Wistar大鼠分为正常组(5只)、模型组(18只)和扶正化瘀方组(14只)。模型组和扶正化瘀组大鼠采用二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)腹腔注射复制大鼠肝纤维化模型。灌胃治疗4周后,采用盐酸水解法检测肝组织中羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,蛋白质印迹法分析肝组织中TGF-β1、TGF-β1Ⅰ型受体(TGF-β1 type Ⅰ receptor,TβR-Ⅰ)、Smad2、Smad3及磷酸化Smad2/3蛋白的表达。体外实验采用培养4d的原代大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),分为对照组、TGF-β1组、10%扶正化瘀方药物血清组及TβR-Ⅰ胞内激酶抑制剂(SB-431542)组。后3组用2.5ng/mLTGF-β1刺激24h后,对照组及TGF-β1组加10%正常大鼠血清,10%扶正化瘀方药物血清组加10%服用扶正化瘀方的大鼠血清,SB-431542组加10%正常大鼠血清及10μmol/LSB-431542。共孵育24h后,免疫荧光染色检测HSC中α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Smad3蛋白的表达,蛋白质印迹法分析HSC中α-SMA蛋白的表达。结果:体内实验发现,扶正化瘀方可明显降低纤维化肝组织中异常升高的Hyp含量及TGF-β1、TβR-Ⅰ、磷酸化Smad2/3蛋白的表达。体外研究发现,正常HSC中α-SMA、TβR-Ⅰ表达较低,TGF-β1刺激可显著上调其表达;扶正化瘀方药物血清共孵育后,可明显抑制TGF-β1诱导的HSC中α-SMA的表达;正常HSCSmad3主要表达在细胞质中,细胞核中表达较低,TGF-β1可显著刺激Smad3向细胞核转移,扶正化瘀方药物血清可明显抑制TGF-β1诱导的Smad3核转位。结论:扶正化瘀方可下调纤维化大鼠肝脏及HSC中的TGF-β1/Smad病理信号转导通路,这可能是扶正化瘀方抗肝纤维化的部分作用机制。

灯盏花素对肝纤维化大鼠的干预作用及机制

目的基于转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad2/胞外信号调节激酶1(ERK1)通路和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)/核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)通路,探讨灯盏花素对肝纤维化(HF)大鼠的干预作用及潜在机制。方法将60只大鼠随机分为正常对照组,模型组,灯盏花素低、中、高剂量组(5.4、10.8、21.6 mg/kg)和秋水仙碱组(阳性对照,0.45 mg/kg),每组10只,雌雄各半。除正常对照组外,其余各组大鼠均以四氯化碳诱导构建HF模型。随后,各药物组大鼠灌胃相应药液,每天1次,连续28 d。观察各组大鼠的肝脏外观并计算其肝脏系数,检测其血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平和肝组织中ALT、AST、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平,观察其肝组织炎症和纤维化情况,检测肝组织中TGF-β1、Smad、ERK1、Nrf2、Keap1、HO-1蛋白及mRNA的表达情况。结果与正常对照组比较,模型组大鼠肝脏可见大面积的白色结节灶、明显的炎症细胞浸润和胶原纤维沉积;其体重,肝组织中SOD、GSH-Px水平和Nrf2、HO-1蛋白及mRNA的表达水平均显著降低(P<0.05);肝脏系数,Masson染色阳性面积百分比,血清及肝组织中ALT、AST水平,肝组织中MDA水平和TGF-β1、Smad2、ERK1、Keap1蛋白及mRNA的表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,各药物组大鼠肝组织病变均有所改善,上述定量指标普遍逆转(P<0.05)。结论灯盏花素对大鼠HF有较好的干预作用,其作用可能与抑制TGF-β1/Smad2/ERK1通路来抗纤维化,调控Keap1/Nrf2/HO-1通路来抑制氧化应激有关。

雷公藤红素改善2型糖尿病大鼠肝纤维化的机制探讨

目的:探讨雷公藤红素(CEL)对2型糖尿病(T2DM)所致的肝纤维化的改善作用及其内在机制。方法:建立T2DM大鼠模型,将24只雄性SD大鼠分成4组,即空白对照(Con)组、对照给药(CEL)组、模型(T2DM)组和模型给药(T2DM+CEL)组。每周监测各组大鼠体质量和空腹血糖(FBG),T2DM造模成功2周后给予CEL 3 mg/(kg·d)灌胃,1次/天持续12周,检测血清空腹胰岛素(FINS)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)及肝组织羟脯氨酸(Hyp)水平。肝组织切片行Masson染色和天狼猩红染色,观察肝组织纤维化程度和胶原蛋白沉积。Western blot检测肝组织α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、沉默信息调节因子1(SIRT1)、TGF-β1和Smad3的蛋白表达变化。结果:与Con组比较,T2DM组大鼠24 h尿量、FBG、FINS、AST、ALT、Hyp水平均升高(P<0.001);胶原容积分数(CVF)升高(P<0.001);肝组织α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、Smad3蛋白表达量均升高(P<0.05),SIRT1蛋白表达量降低(P<0.01)。与T2DM组相比,给予CEL后大鼠24 h尿量、FBG、FINS、AST、ALT、Hyp水平均降低(P<0.05);肝组织胶原沉积减少,纤维化状况改善;肝组织SIRT1表达升高(P<0.05),纤维化相关蛋白表达水平均降低(P<0.05)。结论:CEL可减轻T2DM大鼠肝脏组织的纤维化,其机制可能与调控SIRT1、抑制TGF-β/Smad信号通路有关。

Smad6信号干扰对MSCs骨向分化中Smad5及Smurf1基因表达的影响

目的研究在骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)骨向分化中Smad6信号干扰对Smad5、Smurf1基因表达的影响。方法培养小鼠骨髓MSCs,并分为3组:A组为对照细胞;B组细胞用携带绿色荧光蛋白(GFP)的空白载体病毒转染+BMP-2骨向诱导;C组细胞用Smad6重组RNA干扰载体转染+BMP-2诱导。结果病毒转染后GFP在MSCs中有效表达,病毒转染效率接近100%。与A组比较,BMP-2诱导24h显著提高了B组Smurf1 mRNA水平(P<0.01);而Smad6信号干扰在两个时间点则进一步提高了C组Smurf1 mRNA水平,并显著高于B组(P<0.01)。C组磷酸化的Smad5(pSmad5)和Smurf1水平在两个时间点也显著高于B组(P<0.01),而Smad5蛋白水平则未受影响。结论在BMP-2诱导的MSCs骨向分化中,Smad6 RNA干扰可促进Smad5磷酸化,并引起Smurf1基因表达代偿性增高。