和厚朴酚通过SMAD2/3通路抑制胰腺癌KPC小鼠肿瘤生长及其原代细胞的侵袭和迁移

目的:探究和厚朴酚(honokiol,HNK)在胰腺癌KPC小鼠(LSL-Kras^(G12D/+);Trp53^(fl/+);Pdx1-Cre)肿瘤生长及其原代肿瘤细胞侵袭、迁移及上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)中的作用和机制。方法:自发性胰腺癌转基因小鼠KPC成瘤后灌胃给药,1个月后剖杀观察肿瘤大小和周围浸润情况,免疫组化染色检测EMT相关指标;提取KPC小鼠原代肿瘤细胞培养,以不同浓度和厚朴酚干预,Transwell小室检测其侵袭、迁移能力,Westren blot检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-SMAD2/3、t-SMAD2/3蛋白的表达;利用分子对接模型,预测和厚朴酚和SMAD2的最小距离氢键结合位置;使用外源性TGF-β1作为SMAD2/3的激动剂,联合和厚朴酚,干预肿瘤细胞,Transwell小室和Western blot检测细胞侵袭、迁移和EMT相关蛋白表达情况。结果:和厚朴酚能抑制KPC小鼠自发胰腺肿瘤的大小和EMT,细胞实验也证实和厚朴酚能抑制KPC小鼠原代肿瘤细胞的侵袭、迁移,抑制N-cadherin、Vimentin蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达,同时抑制SMAD2/3的磷酸化。软件预测SMAD2的459号脯氨酸残基与和厚朴酚羟基形成0.24 nm的氢键。回复实验证实和厚朴酚能够抑制TGF-β1激活SMAD2/3促进的胰腺癌细胞的侵袭、迁移和EMT。结论:动物和细胞实验都证实和厚朴酚可能封闭SMAD2蛋白质口袋,抑制SMAD2/3的磷酸化,进而抑制KPC小鼠肿瘤的侵袭、迁移和EMT。

益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面TGF-β/ALK5/Smad2/3通路的影响

目的 :探讨益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面转化生长因子-β(TGF-β)/激活素受体样激酶(ALK)5/Smad蛋白2/3通路的影响。方法 :将50只大鼠随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组、糖尿病对照组、正常对照组。通过腹腔注射链脲佐菌素和外科方法建立糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型,运用Westernblot技术手段分别检测各组肉芽增生期创面成纤维细胞ALK5/Smad2/3的表达水平。结果:糖尿病对照组ALK5表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组ALK5表达水平明显低于糖尿病对照组(P<0.05),其与益气组、化瘀组、正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。糖尿病对照组smad2表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组smad2表达水平与各组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病对照组smad3表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组smad3表达水平低于化瘀组(P<0.05),明显低于糖尿病对照组、益气组(P<0.01),高于正常对照组(P<0.05)。结论:糖尿病创面难以愈合及瘢痕形成的机制可能与ALK5/Smad2/3通路有关,益气化瘀中药可能通过抑制ALK5/Smad2/3通路,加速创面愈合,减少瘢痕形成。

益肾降糖饮对糖尿病肾脏病大鼠TGF-β1/SMAD2/3信号通路的调节作用

目的:观察益肾降糖饮对糖尿病肾脏病(DKD)大鼠TGF-β1/SMAD2/3信号通路的调节作用。方法:随机将30只大鼠分为对照组、模型组、益肾降糖饮低剂量组、益肾降糖饮高剂量组、达格列净组,以柠檬酸缓冲液溶解的1%链脲佐菌素(STZ)经腹腔注射建立DKD大鼠实验模型。经8w治疗后,检测并比较各实验组大鼠禁食状态下的血糖、24h尿蛋白、肾组织病理的变化,以及转化生长因子-β1(TGF-β1)/SMAD2/3信号通路、纤维粘连蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。结果:与模型组比较,益肾降糖饮低剂量组、益肾降糖饮高剂量组大鼠的肾重指数、空腹血糖、24h尿蛋白、TGF-β1、SMAD2/3、纤维粘连蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及肾纤维化程度均明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:益肾降糖饮可通过干预TGF-β1/SMAD2/3信号传导,从而延缓DKD大鼠肾纤维化的进展。

基于TGF-β1/Smad2/3信号通路探讨茴香胶囊抗支气管哮喘作用及机制

目的探讨茴香胶囊抗支气管哮喘作用及潜在机制。方法采用环磷酰胺腹腔注射法建立小鼠免疫低下模型评价茴香胶囊免疫增强作用;采用浓氨水引咳法及酚红排泄法评价茴香胶囊止咳祛痰活性;采用卵清蛋白致敏和激发方式构建支气管哮喘小鼠模型,实验过程中观察并记录小鼠体重及行为学变化;检测小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞计数;ELISA法检测免疫球蛋白E(IgE)、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-17A(IL^(-1)7A)、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平;HE和Masson染色观察肺组织病理学变化;RT-qPCR、Western blot检测TGF-β1/Smad2/3通路相关蛋白表达。结果茴香胶囊可增强免疫低下小鼠的免疫功能,延长小鼠咳嗽潜伏期,减少小鼠咳嗽次数,增加小鼠气管酚红排泌量,降低支气管哮喘小鼠BALF中白细胞等炎性细胞数量,降低IgE、IL-4、IL^(-1)7A、TGF-β1水平,增加IFN-γ水平,减轻小鼠肺组织病理学变化;下调TGF-β1/Smad2/3通路相关蛋白表达。结论茴香胶囊可能通过增强机体免疫力、止咳祛痰缓解支气管哮喘小鼠哮喘症状,调节Th1/Th2失衡、降低肺组织中炎症因子水平、下调TGF-β1/Smad2/3信号通路减少气道炎症及气道重塑。

ALK4-Smad2/3信号通路在特发性肺纤维化中的作用及机制研究

目的:探讨ALK4对肺纤维化的作用及其机制。方法:野生型(ALK4^(+/+))小鼠和ALK4^(+/-)小鼠分别分为生理盐水组(对照组)及博来霉素模型组(实验组),使用HE及Masson两种染色观察肺纤维化程度,使用Western印迹检测ALK4、p-Smad2、p-Smad3及t-Smad2/3的蛋白表达水平,使用RT-qPCR检测CollagenⅠ、Fibronectin、α-SMA的mRNA表达水平,独立样本t检验统计实验数据。结果:ALK4在博来霉素诱导的肺纤维化组织中表达水平显著升高(P<0.05);低表达ALK4抑制了博来霉素诱导的肺纤维化;博来霉素诱导的肺纤维化小鼠中ALK4^(+/-)组CollagenⅠ、Fibronectin、α-SMA的mRNA表达明显低于ALK4^(+/+)组(P<0.05);博来霉素诱导的肺纤维化小鼠中ALK4^(+/-)组的p-Smad2、p-Smad3表达水平均显著低于ALK4^(+/+)组(P<0.05)。结论:下调ALK4表达可以抑制Smad2/3信号传导,进而抑制肺间质纤维化的形成,因此ALK4可能成为特发性肺纤维化的潜在治疗靶点。

三子养亲汤调控TGF-β1/Smad2/3信号通路抑制哮喘模型小鼠气道上皮间质转化的作用机制研究

目的:探讨三子养亲汤对哮喘模型小鼠气道上皮间质转化(EMT)的影响及其可能的分子机制。方法:将40只Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组(每日0.75 mg/kg)和三子养亲汤低、高剂量组(每日5.4、10.8 g/kg),每组8只。除正常组外其余各组小鼠采用鸡卵白蛋白(OVA)腹腔注射及滴鼻激发方式制作哮喘模型,于造模开始后第14天始,各给药组分别灌胃给予相应药物,正常组及模型组灌胃等量无菌水,各组均连续灌胃14 d。末次激发24 h后,每组随机选6只小鼠依次放入全体容积描计箱内,以不同浓度的氯化乙酰甲基胆碱(Mch)雾化1 min后,测定激发5 min内小鼠支气管收缩参数增强呼吸间歇(Penh)。随后各组小鼠予10%水合氯醛腹腔注射麻醉,摘眼球取血,分离血清,-80℃保存备测,取每组6只小鼠血清运用酶联免疫吸附法测定免疫球蛋白E(Ig E)水平。处死小鼠,取每组3只小鼠左上肺叶组织,苏木精伊红(HE)染色后观察小鼠肺组织病理。取每组6只小鼠右上肺组织,蛋白质免疫印迹(Westernblot)法检测肺组织TGF-β1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)相对表达量及磷酸化细胞信号转导分子2/3(P-Smad2/3)蛋白相对表达量。结果:经Mch激发后,模型组小鼠Penh值明显高于正常组(P<0.01);各给药组Penh值不同程度低于模型组,其中以地塞米松组(Mch各激发剂量)和三子养亲汤高剂量组(Mch=25.000 g/L)降低最为明显(P<0.01)。模型组小鼠血清IgE水平明显高于正常组(P<0.01),三子养亲汤低剂量组、地塞米松组小鼠血清IgE水平明显低于模型组(P<0.05)。与正常组比较,模型组小鼠肺组织炎症水平增加,气道平滑肌增厚,气道上皮细胞排列紊乱伴部分上皮细胞脱落;各给药组小鼠上述病理改变均明显改善,以三子养亲汤高剂量组及地塞米松组改善更为显著。模型组小鼠肺组织N-cadherin、α-SMA蛋白表达水平显著高于正常组(P<0.01),E-cadherin蛋白表达水平显著低于正常组(P<0.01);三子养亲汤高剂量组、地塞米松组小鼠肺组织E-cadherin蛋白相对表达量明显高于模型组(P<0.01),三子养亲汤各剂量组小鼠肺组织N-cadherin蛋白相对表达量明显低于模型组(P<0.01),各给药组小鼠肺组织α-SMA相对表达量均明显低于模型组(P<0.05,P<0.01)。模型组小鼠肺组织TGF-β1,P-Smad2/Smad2及P-Smad3/Smad3水平均显著高于正常组(P<0.01,P<0.05);三子养亲汤各剂量组小鼠肺组织上述蛋白相对表达量均显著低于模型组(P<0.05,P<0.01);三子养亲汤低剂量组TGF-β1水平及三子养亲汤各剂量组P-Smad2/Smad2水平均明显低于地塞米松组(P<0.05,P<0.01)。结论:三子养亲汤可能通过降低TGF-β1表达,抑制Smad2/3信号通路激活,从而减少哮喘气道EMT改变,达到治疗哮喘的目的。

基于TGF-β1/Smad2/3信号通路研究芪参六味方对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响

目的:采用芪参六味方干预自发性高血压大鼠(SHR)心肌纤维化(MF)模型,观察其对大鼠MF的影响并探讨其作用机制。方法:SHR大鼠15只,分为模型组、中药组和氯沙坦钾组,每组5只。另魏-凯二氏大鼠(WKY)5只作为对照组。干预12周后检测各组大鼠超声心动图,处死后取左室心肌组织进行相关检测。采用Masson染色及苦味酸-天狼猩红染色,观察心肌组织胶原含量与分布;采用Western blot法测定各组大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)、基质金属蛋白酶(MMP)-9、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1、转化生长因子(TGF)-β1、Smad2、Smad3蛋白的表达;采用RT-PCR法检测TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表达。结果:干预12周后,与模型组比较,中药组镜下胶原纤维明显减少,排列较均匀,E/E’、心肌组织胶原纤维面积百分比、CollagenⅠ/CollagenⅢ明显降低(P<0.05),CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-9、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达量均降低(P<0.05),TGF-β1、Smad2 mRNA表达量下降(P<0.05)。结论:芪参六味方可通过调控TGF-β1/Smad2/3信号通路,减轻细胞外基质的沉积,改善SHR大鼠心肌纤维化。

基于TGF-β1/Smad2/3信号通路探究刺梨多糖缓解运动性免疫抑制发生的机制

目的:探究刺梨多糖介导转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGFβ)信号通路缓解运动性免疫抑制发生的信号转导机制。方法:SPF级SD大鼠40只,随机分为正常对照组(C组)、运动训练组(E组)、运动+小剂量刺梨多糖组(ES组)和运动+大剂量刺梨多糖刺梨组(EB组)。以递增负荷跑台训练模式建模免疫抑制大鼠模型,运动期间ES组、EB组分别以100 mg/kg和200 mg/kg的剂量灌胃刺梨多糖,C组、E组以等剂量的生理盐水灌胃,记录大鼠每周的体质量。试验结束后,取外周血和脾脏,观察脾脏组织结构病理变化、测定各组大鼠鼻腔液中分泌型免疫球蛋白(sIgA)的水平、外周血中CD4+、CD8+、INF-γ、IL-4的水平和脾脏组织中TGF-β1、TGF-β1受体2(TGF-βreceptor,TβR2)、Smad2/3的相对表达水平。结果:与C组相比,E组体质量、sIgA含量降低(P<0.01);脾脏组织结构病理变化明显;外周血CD4+含量降低(P<0.01)、CD4+/CD8+下降(P<0.05)、INF-γ/IL-4下降(P<0.01)、INF-γ、IL-4含量升高(P<0.01);组织TGF-β1蛋白表达升高(P<0.01)、Smad2/3蛋白表达降低(P<0.01)。与E组相比,ES、EB组体质量、sIgA含量增加(P<0.01);脾脏组织结构病理变化显著减少;外周血CD4+含量升高(P<0.05)、CD4+/CD8+升高(P<0.05)、INF-γ/IL-4升高(P<0.01)、INF-γ含量降低(P<0.05)、IL-4含量降低(P<0.01);组织TGF-β1蛋白表达降低(P<0.01)、Smad2/3蛋白表达水平升高(P<0.01),且组间存在量效关系。结论:刺梨多糖可介导TGF-β1/Smad2/3信号通路下调TGF-β1和上调Smad2/3蛋白的表达,促进T淋巴细胞的分化,调控T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+和细胞因子INF-γ/IL-4的稳态,缓解运动性免疫抑制的发生。

基于TGF-β1/Smad2/3通路探讨芹菜素对糖尿病肾病大鼠肾纤维化的保护作用

目的:研究芹菜素对糖尿病肾病(DN)大鼠肾纤维化的保护作用及相关机制。方法:将60只雄性SD大鼠按随机数字表法平均分为6组(n=10):正常对照组、模型对照组、二甲双胍500 mg/kg组和芹菜素10、20、40 mg/kg组。除正常对照组外,其余各组大鼠均采用腹腔注射链脲佐菌素65 mg/kg联合高脂高糖喂养12 w的方法复制DN大鼠模型。造模完成后,各组分别连续28 d灌胃给予相应药物或生理盐水,1次/d。给药前和给药后第7、14、21、28 d检测空腹血糖(FBG)含量;28 d后,称体质量并测量24 h尿量,生化分析法检测24 h尿蛋白量(24 h-Pro)和血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)含量,HE染色法观察肾组织病理学改变,Masson染色法观察肾组织纤维化状况,Western blot法检测肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3、Smad2/3、I型胶原蛋白(Col-I)、III型胶原蛋白(Col-III)表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠FBG含量、24 h尿量、24 h-Pro和血清BUN、SCr含量均显著升高(P<0.01),体质量显著降低(P<0.01);肾组织可见肾小球体积增大、系膜增生,肾小管扩张,肾间质大量炎性细胞浸润等病理学改变及肾小球、肾小管间质纤维化,胶原容积分数(CVF)显著升高(P<0.01);TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad2/3、Col-I、Col-III蛋白表达显著上调(P<0.01);与模型对照组比较,芹菜素20、40 mg/kg组和二甲双胍500 mg/kg组治疗14 d后FBG含量显著降低(P<0.05或P<0.01);治疗28 d后,体质量显著升高(P<0.05或P<0.01),24 h尿量、24 h-Pro和血清BUN、SCr含量均显著降低(P<0.01),肾组织病理学改变及肾小球、肾小管间质纤维化均明显改善,CVF显著降低(P<0.01),TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad2/3、Col-I、Col-III蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01)。结论:芹菜素可抑制TGF-β1/Smad2/3通路进而抑制DN大鼠肾纤维化,保护肾组织结构和功能。

搜风愈喘方调控TGF-β1/Smad2/3信号通路干预哮喘大鼠气道重塑的作用机制

目的:探讨搜风愈喘方调控转化生长因子-β1及其信号转导蛋白Smad(TGF-β1/Smad)信号通路干预哮喘大鼠气道重塑的作用机制。方法:将32只SPF级SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、地塞米松0.000125 g/kg组和搜风愈喘方11.4 g/kg组,除正常对照组外,其余大鼠均制备慢性哮喘模型,造模成功后各组分别予蒸馏水和对应药物灌胃,连续21 d。观察各组一般情况;ELISA法检测大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素-13(IL-13)含量;HE染色、PAS染色和Masson染色观察大鼠肺组织病理改变、杯状细胞分泌黏液及气道胶原沉积情况;记录支气管管腔内周长(Pi)、气道管壁面积(WAt)、气道平滑肌层面积(WAm)、观察大鼠气道重塑情况;透射电镜观察大鼠肺组织中上皮细胞和平滑肌细胞情况;Real-time PCR法检测大鼠肺组织Tgfb1、Smad2、Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,Asma)、Vegf和Il13 mRNA表达;Western blot法检测大鼠肺组织TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠存在呼吸深快、烦躁喘促等症状且BALF中TGF-β1、VEGF和IL-13含量显著升高(P<0.01);肺组织中广泛可见炎性细胞浸润、杯状细胞增生以及胶原纤维沉积;气道重塑相关指标显著升高(P<0.01);肺组织超微结构显示肺组织中上皮细胞和平滑肌细胞水肿程度严重,胞内基质溶解、变淡,胶原纤维排列紊乱,细胞器和线粒体肿胀;Tgfb1、Smad2、Smad3、Asma、Vegf和Il13 mRNA相对表达显著上调(P<0.01);TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA蛋白表达显著上调(P<0.01);与模型对照组比较,地塞米松0.000125 g/kg组和搜风愈喘方11.4 g/kg组大鼠呼吸平缓,精神活跃;大鼠BALF中TGF-β1、VEGF、IL-13含量显著降低(P<0.01),支气管周围炎性细胞浸润程度减轻、杯状细胞增生不明显且胶原纤维沉积情况明显改善,气道重塑相关指标明显降低(P<0.05或P<0.01);超微结构显示肺组织上皮细胞和平滑肌细胞水肿程度明显减轻,胞内基质均匀,线粒体未见明显肿胀;Tgfb1、Smad2、Smad3、Asma、Vegf和Il13 mRNA表达下调(P<0.05或P<0.01);TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01)。结论:搜风愈喘方可通过减少细胞外基质合成、抑制平滑肌细胞增生和上皮间质转化(EMT),干预哮喘大鼠气道重塑,降低TGF-β1、VEGF和IL-13含量,且与抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路传导,下调TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA表达相关。

基于“痰瘀生风”理论研究中药复方调控TGF-β1/Smad2/3/α-SMA信号通路治疗痰浊血瘀型PAF的机制研究

目的基于“痰瘀生风”理论,以转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad2/3/α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)信号通路为切入点探究中药复方抑制心房纤维化,改善痰浊血瘀型阵发性房颤大鼠心房重构的可能机制。方法将60只SD大鼠,随机分为对照组、模型组、中药复方高剂量组、中药复方中剂量组、中药复方低剂量组和维拉帕米组(n=10)。采用尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙(Ach-CaCl2)联合喂养高脂饲料方法建立痰浊血瘀型阵发性房颤大鼠模型,造模成功后,第2天开始灌胃,对照组及模型组采用等体积生理盐水灌胃,中药复方高剂量41.25g/(kg·d)、中剂量20.63g/(kg·d)、低剂量10.31g/(kg·d),日1次灌胃,维拉帕米组维拉帕米溶液25mg/(kg·d)日1次灌胃,用药干预2周后,心电图记录各组大鼠房颤持续时间、透射电镜观察大鼠心房肌组织超微结构,运用Western Blot法检测心房TGF-β1、Smad2/3、α-SMA蛋白表达。结果心电图显示造模成功,且与模型组相比,中药复方各剂量组及维拉帕米组大鼠房颤持续时间显著缩短(P<0.05);透射电镜下观察到心房肌细胞的肌小节轻微断裂,肌丝间未出现间隙;同时TGF-β1、Smad2/3、α-SMA表达显著下降(P<0.05)。结论中药复方可能通过调控TGF-β1/Smad/α-SMA通路相关蛋白的表达,抑制心房纤维化,改善心房重构,进而减少阵发性房颤的发生。

糖肾康中药复方含药血清对高糖环境下RMCs的增殖及TGF-β1/Smad2/3信号通路的影响

目的研究糖肾康中药复方含药血清对高糖环境下大鼠肾系膜细胞(RMCs)增殖及TGF-β1/Smad2/3信号通路的影响。方法 12只SD大鼠采用随机数字法分为小剂量中药组、中剂量中药组、大剂量中药组,空白组,每组3只,灌胃7天后门静脉取血。分别用含中药血清和普通大鼠血清培养RMCs。采用4-甲偶氮唑蓝(MTT)法测定系膜细胞的增殖率,以确定最佳中药血清浓度;实时定量、PCR及酶联免疫吸附剂(ELISA)法测定TGF-β1mRNA及蛋白的表达,蛋白免疫印迹(Western blot)及免疫荧光方法测定Smad2/3蛋白表达及磷酸化水平。结果不同剂量的糖肾康中药含药血清均能抑制大鼠肾小球系膜细胞的增殖;中药血清可显著抑制高糖诱导的TGF-β1表达及Smad2/3磷酸化。结论糖肾康中药含药血清能抑制高糖刺激下的RMCs增殖,其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad2/3通路有关。

乙氧基血根碱改善血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化的实验研究

目的 探讨乙氧基血根碱对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠心肌纤维化的影响及作用机制。方法 构建AngⅡ诱导的高血压小鼠心肌纤维化模型,根据小鼠的基线血压随机分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性药组。除空白组之外的其余各组小鼠皮下以500 ng/(kg·min)的速率释放AngⅡ,空白组在泵内注入等量体积生理盐水,持续4周;低、中、高剂量组从术后第1天起分别给予0.1、1、10 mg/(kg·d)乙氧基血根碱灌胃,空白组和模型组给予等体积生理盐水,阳性药组给予10 mg/(kg·d)缬沙坦,连续灌胃给药28 d。采用Masson染色及天狼星红染色法检测6组小鼠心肌纤维化及胶原沉积情况;Western blot检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、增殖细胞核抗原(PCNA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)及TGF-β1/smad2/3信号通路相关蛋白TGF-β1、p-smad2/3、smad2/3的蛋白表达量。结果 与空白组比较,模型组小鼠心肌细胞出现明显纤维化及胶原沉积,心脏组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、PCNA、α-SMA及FN的蛋白表达显著增加(P<0.05),通路相关蛋白TGF-β1表达、p-smad2/smad2比值及p-smad3/smad3比值显著上调(P<0.05),而乙氧基血根碱给药后,心肌的纤维化及胶原沉积情况均明显改善,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、PCNA、α-SMA、FN、TGF-β1等蛋白表达及p-smad2/smad2和p-smad3/smad3比值均显著下调(P<0.05),且乙氧基血根碱对小鼠心肌纤维化改善的作用呈剂量依赖性(P<0.05)。结论 乙氧基血根碱可改善AngⅡ诱导的心肌纤维化,通过抑制TGF-β/smad2/3通路的活化可能是其发挥作用的机制之一。

滇龙胆草调控TGF-β1/Smad2/3信号通路抑制肺纤维化小鼠肺上皮间质转化

目的:研究滇龙胆草对肺纤维化小鼠转化生长因子β1及其信号转导蛋白Smad(TGF-β1/Smad)信号通路和肺上皮间质转化的影响。方法:健康雄性昆明小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、吡非尼酮50 mg/kg组、滇龙胆草50、100、200 mg/kg组。气管滴注博莱霉素5 mg/kg制备小鼠肺纤维化模型,造模同时各组灌胃相应药物或CMC混悬液,建模第28 d,摘眼球取血,取肺组织进行检测;HE染色检测小鼠肺组织病理变化;Masson染色检测肺组织胶原沉积;羟脯氨酸试剂盒测定小鼠肺组织中的羟脯氨酸含量;ELISA检测小鼠血清中转化生长因子(TGF-β1)含量;Western blot检测肺组织中TGF-β1、Smad2/3、E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达;免疫组织化学检测小鼠肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-Cadherin表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组小鼠肺组织结构破坏,肺泡壁增厚,支气管周围可见大量纤维组织增生、胶原沉积,肺泡炎评分和肺纤维化评分增加,肺组织羟脯氨酸含量增多,血清TGF-β1含量增多,肺组织中TGF-β1、Smad2/3、α-SMA蛋白表达显著上调,E-Cadherin蛋白表达显著下调(P<0.01);与模型对照组比较,滇龙胆草各剂量组及吡非尼酮50 mg/kg组胶原沉积减少,肺组织病变改善,肺泡炎评分和肺纤维化评分降低,肺组织羟脯氨酸含量减少,TGF-β1、Smad2/3、α-SMA蛋白表达下调,E-Cadherin蛋白表达上调,血清TGF-β1含量降低(P<0.05或P<0.01)。结论:滇龙胆草对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化具有保护作用,其机制与调控TGF-β1/Smad2/3信号通路抑制肺上皮-间质转化有关。

苗药宽叶腹水草对CCl_(4)致肝纤维化小鼠的治疗作用及其机制研究

目的:研究苗药宽叶腹水草对CCl_(4)所诱导肝纤维化小鼠的治疗作用及可能机制。方法:将60只SPF级昆明小鼠随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱(0.2 mg/kg)组及宽叶腹水草水提物低(200 mg/kg)、中(400 mg/kg)、高(800 mg/kg)剂量组,每组10只。除正常对照组外,其余各组小鼠均皮下注射CCl_(4)(CCl_(4)与橄榄油溶液1∶1混合)诱导肝纤维化,2次/w,连续8 w。从造模第5周开始,正常对照组和模型组小鼠灌胃生理盐水,其余各组小鼠均灌胃相应药物治疗,1次/d,连续4 w。末次给药处死所有小鼠后,收集肝脏,计算肝脏指数,HE及Masson染色观察肝组织病理学变化;全自动生化仪检测肝功能指标ALT、AST、ALP、ALB、TP水平;ELISA法检测纤维化指标PCⅢ、ColⅣ、LN、HA及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平;试剂盒检测小鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平;Western Blot检测肝组织中α-SMA、TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表达。结果:宽叶腹水草能显著升高CCl_(4)诱导肝纤维化小鼠体质量,降低肝脏指数,减少肝组织炎症浸润及胶原沉积,显著升高血清ALB、TP、SOD、GSH-Px水平,显著降低血清ALT、AST、ALP、PCⅢ、ColⅣ、LN、HA、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平及肝组织中TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白表达。结论:宽叶腹水草对CCl_(4)诱导肝纤维化小鼠具有治疗作用,其机制可能与抑制TGF-β/Smad2/3信号通路、炎症反应及氧化应激有关。

替米沙坦对糖尿病大鼠血脂代谢及细胞免疫功能影响的机制研究

目的探讨替米沙坦对糖尿病大鼠血脂代谢及免疫功能的影响机制。方法建立糖尿病大鼠模型;将50大鼠分为对照组、模型组、替米沙坦组、TGF-β1抑制剂组、TGF-β1激活剂组,每组10只,喂养至第12周,统一处理大鼠;血糖分析仪检测各组大鼠的血糖水平;全自动生化仪检测各组大鼠的血脂水平;流式细胞中检测各组大鼠血清中CD4^+、CD8^+、CD4^+/CD8^+的水平;ELISA实验检测血清中IL-6、IL-2的表达水平;Western blot检测各组大鼠肾脏组织中TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠血糖含量、TG、TC、CD8^+、IL-6均显著升高,HDL-C、CD4^+、CD4^+/CD8^+、IL-2均显著降低(P<0.05);替米沙坦、TGF-β1抑制剂均可改善糖尿病大鼠的血糖血脂及T淋巴细胞免疫水平;TGF-β1激活剂可逆转替米沙坦对糖尿病模型大鼠血脂代谢及T淋巴细胞免疫功能的作用。结论替米沙坦对糖尿病大鼠血脂代谢及免疫功能具有改善作用,其机制与失活TGF-β1/Smad2/3信号通路有关,为替米沙坦用于糖尿病的治疗提供理论依据。

黄连素对IL-1β诱导炎性退变软骨细胞增殖的影响及其分子机制

目的观察黄连素对白细胞介素1β(IL-1β)诱导炎性退变软骨细胞增殖的影响,并探讨其可能的作用机制。方法采用酶消化法提取小鼠膝关节软骨细胞,通过镜下观察及甲苯胺蓝染色鉴定证实。使用IL-1β构建软骨细胞炎性退变模型,采用MTT法检测不同浓度黄连素对软骨细胞活性的影响,筛选出对软骨细胞活性有积极作用的低、高两个黄连素浓度(6.25×10^(-3)g/L、0.05 g/L)。将软骨细胞随机分为空白组(不采取任何干预)、模型组(仅加入10 ng/mL IL-1β干预)、黄连素低剂量组(10 ng/mL IL-1β+6.25×10^(-3)g/L黄连素干预)、黄连素高剂量组(10ng/mL IL-1β+0.05 g/L黄连素干预),分组处理后继续培养2 d。采用FDA荧光染色检测细胞增殖活性(活细胞数),番红O染色检测软骨细胞分泌功能(染色面积),Real-time PCR法检测软骨细胞特异性相关基因[蛋白聚糖(Acan)、Ⅱ型胶原1(Col2a1)]及炎症相关基因[基质金属蛋白酶13(MMP-13)、环氧合酶2(COX-2)]表达,Western blotting法检测转化生长因子β(TGF-β)/Smad2/3信号通路相关蛋白(TGF-β_(1)、Smad2、Smad3)表达。结果模型组、空白组、黄连素低剂量组、黄连素高剂量组活细胞数分别为(212.50±17.68)、(375.00±35.35)、(530.00±42.43)、(650.00±70.71)个,组间两两比较P均<0.05。模型组、空白组、黄连素低剂量组、黄连素高剂量组染色面积分别为24.50%±4.95%、44.50%±6.36%、65.00%±7.07%、77.5%±3.53%,组间两两比较P均<0.05。模型组、空白组、黄连素低剂量组、黄连素高剂量组软骨细胞Acan、Col2a1 mRNA及TGF-β_(1)、Smad2、Smad3蛋白表达均依次升高,MMP-13、COX-2 mRNA表达均依次降低,组间两两比较P均<0.05。结论黄连素可促进IL-1β诱导炎性退变软骨细胞的增殖及活性,其机制可能与抑制炎症反应及激活TGF-β/Smad2/3信号通路有关。

miR-27a-3p对子宫内膜异位症异位内膜细胞迁移、侵袭和上皮间充质转化的影响

目的探究miR-27a-3p对子宫内膜异位症异位内膜细胞迁移、侵袭和上皮间充质转化的影响及可能机制。方法收集子宫内膜异位症患者在位内膜及异位内膜组织,qRT-PCR检测组织miR-27a-3p和YAP1mRNA表达;生物信息学预测YAP1 mRNA与miR-27a-3p的潜在结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证;将miR-27a-3p模拟物及YAP1过表达质粒转染原代培养的异位内膜组织子宫内膜基质细胞,qRT-PCR检测细胞miR-27a-3p和YAP1 mRNA表达,Western blot检测细胞YAP1蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测细胞EMT标志物以及TGF-β2/Smad2/3信号通路相关蛋白表达。结果miR-27a-3p在异位内膜组织中低表达,YAP1 mRNA在异位内膜组织中高表达;miR-27a-3p与YAP1 mRNA靶向结合;转染miR-27a-3p模拟物增加异位内膜组织子宫内膜基质细胞miR-27a-3p表达,降低细胞YAP1 mRNA和蛋白表达,抑制细胞增殖、迁移和侵袭,且降低细胞N-cadherin、Vimentin、TGF-β2、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达,增加细胞E-cadherin蛋白表达;过表达YAP1增加转染miR-27a-3p模拟物的子宫内膜基质细胞YAP1 mRNA和蛋白表达,促进细胞增殖、迁移和侵袭,且增加细胞N-cadherin、Vimentin、TGF-β2、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达,降低细胞E-cadherin蛋白表达。结论MiR-27a-3p抑制子宫内膜异位症患者异位内膜细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,其机制可能与靶向抑制YAP1表达抑制TGF-β2/Smad2/3信号通路有关。

沙库巴曲缬沙坦改善血管紧张素Ⅱ介导的心房纤维化的机制研究

目的探讨沙库巴曲缬沙坦(Sac/Val)对血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)诱导的小鼠心房纤维化的影响,探讨其对TGFβ1/Smad2/3信号通路的调控作用。方法通过皮下埋植Ang-Ⅱ微量渗透压泵[750 ng/(kg·min)]构建小鼠心房纤维化模型。建模后每日给予60 mg/kg Sac/Val灌胃治疗小鼠(Ang-Ⅱ+Sac/Val组,n=10)。假手术组(n=10)和Ang-Ⅱ模型组(n=10)小鼠给予等体积的生理盐水灌胃。造模后第28天超声心动图评估小鼠心脏结构及功能,心脏组织包埋并切片后天狼星红染色评估心房纤维化程度,心房组织羟脯氨酸含量测定,Western Blot法测定小鼠心房组织中组织转化生长因子-β1(TGF-β1)及磷酸化细胞信号转导分子Smad2/3(p-Smad2/3)的蛋白表达量。20μmol/L Sac/Val预处理后,经1μmol/L Ang-Ⅱ刺激后检测心房成纤维细胞的增殖、表型转化和分泌细胞外基质的能力。结果与Ang-Ⅱ组小鼠相比,Ang-Ⅱ+Sac/Val组小鼠的心房纤维化及左心房扩大程度均明显降低(P<0.05)。Sac/Val孵育心房成纤维细胞可明显抑制Ang-Ⅱ介导的心房成纤维细胞的增殖活性、胶原I(Col1A1)、结缔组织生长因子(CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因的m RNA表达(P<0.05)。同时,Ang-Ⅱ+Sac/Val组小鼠的心房组织中TGF-β1及p-Smad2/3蛋白表达量均低于Ang-II组(P<0.05)。结论Sac/Val通过抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路激活,抑制心房成纤维细胞的增殖、表型转化和分泌细胞外基质的能力,进而明显改善Ang-Ⅱ介导的心房纤维化。

Luspatercept治疗贫血的临床研究进展

转化生长因子(TGF)-β超家族抑制剂luspatercept是一种针对SMAD 2/3信号通路的可溶性受体融合蛋白,该药对改善β地中海贫血、较低危骨髓增生异常综合征(MDS)相关贫血具有较好的临床疗效。美国食品药品监督管理局(FDA)已批准luspatercept用于治疗β地中海贫血和较低危MDS伴环状铁粒幼红细胞(RS)或MDS/骨髓增殖性肿瘤(MPN)伴RS和血小板增多(MDS/MPN-RS-T)相关贫血的成年患者。目前研究结果初步表明,luspatercept对改善骨髓纤维化(MF)相关贫血可能具有临床疗效。随着对luspatercept相关研究的日益深入,该药可能被更广泛地应用于其他疾病相关贫血的治疗。笔者就luspatercept的药理学特性及其治疗贫血的机制、临床疗效、治疗相关不良反应的研究进展进行阐述。