丹曲林对心房颤动大鼠心肌纤维化及TGF-β_(1)/Smad2信号通路的影响

目的:探讨丹曲林对心房颤动大鼠心肌纤维化及转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))/Smad2信号通路的影响。方法:72只SD大鼠采用随机数字表法分为空白对照组、模型组、丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组、丹曲林高剂量+SRI-011381(TGF-β激动剂)组,每组12只。丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组大鼠分别腹腔注射5、10 mg/kg丹曲林;阳性对照组大鼠灌胃20 mg/kg维拉帕米;丹曲林高剂量+SRI-011381组大鼠腹腔注射10 mg/kg丹曲林和30 mg/kg SRI-011381;空白对照组、模型组大鼠腹腔注射等体积生理盐水,每日1次,持续4周。4周后,除空白对照组外,其余各组大鼠均按1 mL/kg尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙混合液(乙酰胆碱66μg/mL+氯化钙10 mg/mL)构建心房颤动模型,空白对照组大鼠尾静脉注射等体积生理盐水,每日1次,持续1周,1周后采集心电图数据并记录心房颤动诱发时间;彩色多普勒超声仪检测左室舒张末期内径(LVEDD)、左室缩短分数(LVFS)、左室射血分数(LVEF)、左室收缩末期内径(LVESD)的变化;苏木精-伊红(HE)染色检测大鼠心肌组织病理损伤;Masson染色检测大鼠心肌纤维化;免疫组化法检测心肌组织中Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅲ)表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)法检测心肌组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测TGF-β_(1)、p-Smad2、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达。结果:与空白对照组比较,模型组大鼠心律不齐,心肌组织病理损伤及纤维化严重,LVEDD、LVESD、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ阳性表达及IL-1β、TNF-α水平以及TGF-β_(1)、p-Smad2、α-SMA蛋白表达升高,LVFS、LVEF降低(P<0.05);与模型组比较,丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组对应指标变化趋势与上述相反,且丹曲林浓度越高,对应的变化趋势越明显(P<0.05);SRI-011381减弱了高剂量丹曲林对心房颤动大鼠心肌纤维化及炎症反应的抑制作用。结论:丹曲林可能通过抑制TGF-β_(1)/Smad2信号通路减轻心房颤动大鼠心肌纤维化及炎症反应。

槲皮素通过抑制TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号通路发挥抗肝纤维化的作用

目的探讨槲皮素抗肝纤维化的潜在作用机制。方法通过腹腔注射10 mg·kg^(-1)二甲基亚硝胺构建大鼠肝纤维化模型,于造模第3周开始灌胃槲皮素(12.5、25、50 mg·kg^(-1))治疗,造模第4周末处死;对肝组织进行HE和胶原染色,检测羟脯氨酸含量;检测肝功能指标和肝纤维化指标的变化;实时定量PCR检测肝星状细胞活化相关因子的表达水平;免疫组织化学法测定肝组织中TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号途径相关蛋白表达水平的变化。采用MTT法和Western blot法检测槲皮素对大鼠肝星状细胞系HSC-T6的增殖的影响以及对TGF-β1诱导的TAK1、JNK、Smad2蛋白磷酸化的抑制作用。结果与模型组相比,槲皮素25和50 mg·kg^(-1)组大鼠肝纤维化程度明显降低;槲皮素(20和40μmol·L^(-1))能显著抑制HSC-T6细胞的增殖,并能有效地降低TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号途径相关蛋白磷酸化程度。结论槲皮素可通过调节TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号通路影响肝星状细胞活化以发挥抗肝纤维化作用。

长链非编码RNA PCGEM1通过转化生长因子β2/Smad2信号通路调控口腔鳞状细胞癌侵袭和转移的机制研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)PCGEM1通过转化生长因子β2(TGFβ2)/Smad2信号通路调控口腔鳞状细胞癌(OSCC)侵袭和转移的机制。方法将60例OSCC患者癌组织及距离癌组织超过2 cm处的正常组织纳入研究,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-148a、lncRNA PCGEM1在OSCC组织及正常组织、人正常口腔黏膜上皮细胞(OMEC)及人源OSCC细胞株KB、BcaCD885、SCC-4、CAL27、SCC-15中的表达情况;分析lncRNA PCGEM1和miR-148a表达与患者临床病理信息之间的关系。构建lncRNA PCGEM1沉默细胞系KB-siPCGEM1及阴性对照(KB-NC),并以KB作为空白对照组,采用MTT、Transwell和划痕实验检测lncRNA PCGEM1对KB细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;使用生物信息学网站starBase预测lncRNA PCGEM1可以互补结合的微小RNA(miRNA),再根据www.microRNA.org网站预测相应miRNA可靶向结合的基因;免疫印迹(Western blotting)检测TGFβ2/Smad2信号通路蛋白表达情况。结果qRT-PCR结果显示,OSCC组织中lncRNA PCGEM1、miR-148a的表达水平高于正常组织(P<0.05);lncRNA PCGEM1和miR-148a在不同TNM分期、淋巴结转移和组织分化程度的患者癌组织中表达差异均有统计学意义(P<0.05);与空白对照组和KB-NC组相比,KB-siPCGEM1组细胞OD492 nm值下降,细胞侵袭数量及迁移率降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);生物信息学预测结果显示,lncRNA PCGEM1可与miR-148a互补结合,miR-148a与TGFβ2存在靶向结合位点;qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,KB-siPCGEM1组中miR148a、TGFβ2及p-Smad 2的表达明显低于空白对照组与KB-NC组(P<0.05),空白对照组和KB-NC组的差异无统计学意义(P>0.05)。结论lncRNA PCGEM1在OSCC中高表达,高表达lncRNA PCGEM1可能通过上调miR-148a水平,强化TGFβ2/Smad2信号通路,从而促进OSCC的进展。

基于TGF-β2/Smad2信号通路探讨长链非编码RNA NEAT1对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)NEAT1调控TGF-β2/Smad2信号通路对膀胱癌(BC)T24细胞上皮间质转化(EMT)和生物学行为的影响及潜在分子机制。方法:收集2015年3月~2018年5月于我院接受手术治疗的128例BC患者癌组织及距离癌组织超过2cm处的正常组织,qRT-PCR检测lncRNA NEAT1在BC及相应的正常组织、不同BC细胞系中的表达情况;以T24为空白对照,构建lncRNA NEAT1沉默细胞系T24-siNEAT1及阴性对照T24-NC,分别采用MTT、平板克隆实验及Transwell实验检测lncRNA NEAT1对T24细胞增殖和侵袭能力;免疫荧光实验检测E-cadherin、Vimentin表达;生物信息学网站starBase预测可与lncRNA NEAT1互补结合的miRNA,根据Targetscan网站预测相应miRNA可靶向结合的基因;Western blot检测TGF-β2/Smad2信号通路蛋白和E-cadherin、Vimentin表达情况。结果:qRT-PCR结果显示,BC组织和癌细胞中lncRNA NEAT1表达水平明显高于正常组织和正常细胞(P<0.05);与空白对照组和T24-NC组相比,T24-siNEAT1组细胞OD 492值明显下降,细胞克隆数、通过matrigel基质胶的数量明显减少,E-cadherin表达明显升高、Vimentin明显降低(P<0.05);starBase网站预测结果显示,lncRNA NEAT1可与miR-200a-3p互补结合,Targetscan网站预测分析显示,miR-200a-3p与TGF-β2存在靶向结合位点;qRT-PCR和Western blot结果显示T24-siNEAT1组中miR-200a-3p、TGF-β2及p-Smad2表达明显低于空白对照组与T24-NC阴性对照组(P<0.05);空白对照组和T24-NC组中上述指标的表达量无统计学意义(P>0.05)。结论:lncRNA NEAT1在BC组织及细胞中高表达,高表达lncRNA NEAT1可能通过上调miR-200a-3p水平强化TGF-β2/Smad2信号通路,促进EMT过程,影响BC进展。

Salen-Mn通过阻滞TGF-β/Smad2信号通路抑制肾细胞癌786-O细胞的侵袭迁移

目的探讨TGF-β/Smad2信号通路在锰-双希夫碱复合物(Salen-Mananese,Salen-Mn)抑制肾细胞癌侵袭转移中的作用。方法 MTT法检测Salen-Mn对肾细胞癌786-O细胞的细胞活性影响。用伤口愈合实验和Transwell侵袭迁移实验检测Salen-Mn对肾细胞癌786-O细胞的侵袭迁移能力。用Western blot以及real-time PCR检测Salen-Mn对肾细胞癌786-O细胞内上皮间质转化相关蛋白标志物(E-cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Snail)的表达。通过Western和siRNA转染技术检测TGF-β/Smad2信号通路在Salen-Mn对EMT调控中的作用。结果 Salen-Mn可以抑制肾细胞癌786-O细胞的增殖和侵袭迁移(P<0.05)。与此同时,Salen-Mn能在mRNA和蛋白水平上调E-cadherin的表达,并下调N-Cadherin、Vimentin和Snail的表达(P<0.05)。Western blot结果显示,Salen-Mn能够抑制肾细胞癌786-O细胞内TGF-β和p-Smad2的表达,且TGF-β的过表达能够逆转Salen-Mn对EMT和侵袭迁移的抑制。结论 Salen-Mn通过下调TGF-β/Smad2信号通路抑制肾细胞癌的侵袭转移,这为肾细胞癌的临床治疗提供了一定的理论依据。

硫化氢通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路改善代谢综合征大鼠的心肌纤维化

目的观察硫化氢对代谢综合征大鼠心肌纤维化及转化生长因子(TGF)-β1/Smad2蛋白表达的影响。方法雄性SD大鼠40只,随机分为正常组、模型组(MS)、硫化氢(H_(2)S)干预组(MS+H_(2)S)、H_(2)S组,每组各10只。MS组和MS+H_(2)S组予以高糖高脂饲料喂养,其余两组则给予普通饲料。建模成功后,MS+H_(2)S组和H_(2)S组予以硫氢化钠(NaHS)〔56 mmol/kg·d)〕腹内注射。经H_(2)S干预6 w后处死各组大鼠,并用Masson染色分析心肌纤维化程度及胶原沉积的情况;Western印迹检测TGF-β1、Smad2蛋白的表达情况。结果与正常组对比,MS组可见显著的胶原沉积和心肌纤维化,且心肌细胞排列无序,而心肌组织中TGF-β1和Smad2蛋白表达明显增加(P<0.05),与MS组相比,MS+H_(2)S组的上述情况均显著改善。结论H_(2)S可改善MS大鼠的心肌纤维化,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad2的表达有关。

KAI1通过调节TGF-β1/Smad2信号通路减弱上皮-间充质转化抑制胃癌细胞的侵袭和迁移

目的探讨KAI1通过调控TGF-β1/Smad2信号通路减弱上皮-间充质转化(EMT)对胃癌细胞侵袭、迁移的影响。方法将人胃癌SGC-7901细胞分为KAI1组、NC组、Control组,KAI1组转染携带KAI1基因的重组慢病毒、NC组转染空病毒、Control组不转染,采用Western blot和qPCR法检测3组细胞KAI1表达情况。用含TGF-β1的培养基培养3组细胞,分别为KAI1+TGF-β1,NC+TGF-β1和TGF-β1组,通过光镜观察各组细胞形态改变;Transwell细胞侵袭和划痕实验分别检测各组细胞的侵袭和迁移能力;Western blot法检测白细胞抑制因子2(Smad2)、磷酸化Smad2(p-Smad2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达水平。结果Western blot和qPCR提示KAI1成功转染人胃癌SGC-7901细胞。在镜下观察发现NC+TGF-β1组和TGF-β1组细胞形态改变明显,而KAI1+TGF-β1组细胞没有出现明显的伪足等结构。KAI1+TGF-β1组细胞侵袭数明显低于NC+TGF-β1组和TGF-β1组(P<0.05)。KAI1+TGF-β1组划痕区域相对距离变化小于NC+TGF-β1组和TGF-β1组;细胞迁移率明显低于NC+TGF-β1组和TGF-β1组(P<0.05)。Western blot提示KAI1+TGF-β1组E-cadherin蛋白表达水平明显高于NC+TGF-β1组和TGF-β1组(P<0.05),而Vimentin,Smad2,p-Smad2蛋白表达水平明显低于NC+TGF-β1组和TGF-β1组(P<0.05)。结论KAI1基因可以通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路抑制EMT,从而抑制胃癌细胞的侵袭、迁移。

黄葵素对糖尿病肾病大鼠氧化应激、炎症反应和TGF-β_(1)/Smad2信号通路的影响

目的探讨黄葵素对糖尿病肾病大鼠氧化应激、炎症反应和TGF-β_(1)/Smad2信号通路的影响。方法将60只成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、黄葵素低剂量组、黄葵素高剂量组,每组15只。造模成功后第2天,黄葵素低剂量组和黄葵素高剂量组分别给予黄葵素75 mg/kg和150 mg/kg灌胃,对照组和糖尿病肾病组给予生理盐水灌胃,均1次/d,连续8周。血糖仪测定各组大鼠空腹血糖(FPG)水平;双缩脲法测定各组大鼠24 h尿蛋白量;全自动生化分析仪检测各组大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平;ELISA检测各组大鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平;HE染色观察各组大鼠肾组织病理变化;Masson染色观察各组大鼠肾组织纤维化情况;免疫组织化学染色检测各组大鼠肾组织中TGF-β_(1)表达情况;ELISA检测各组大鼠肾组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)表达水平;Western blot检测各组大鼠肾组织中TGF-β_(1)和p-Smad2蛋白表达水平。结果与对照组比较,糖尿病肾病组大鼠FPG、SCr、BUN、24 h尿蛋白量及血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平均明显升高(P均<0.05),肾组织坏死明显,可见大量炎性细胞,肾小球和肾小管中有大量蓝色的胶原纤维,肾组织中TGF-β_(1)阳性表达率和肾组织中MDA水平、TGF-β_(1)蛋白表达水平、Smad2蛋白的磷酸化水平均明显升高(P均<0.05),肾组织中SOD和GSH水平均明显降低(P均<0.05)。与模型组比较,黄葵素各组大鼠FPG、SCr、BUN、24 h尿蛋白量、IL-1β、TNF-α、IL-6水平及肾组织中MDA水平、TGF-β_(1)蛋白表达水平、Smad2蛋白的磷酸化水平均明显降低(P均<0.05),肾组织中SOD和GSH水平均明显升高(P均<0.05)。结论黄葵素可减轻糖尿病肾病大鼠的炎症反应、氧化应激和肾损伤,抑制TGF-β_(1)/Smad2信号通路的激活,对糖尿病肾病具有潜在的治疗作用。

GABRA3突变通过抑制TGF-β1/SMAD2信号通路调控神经元的凋亡、突触形成和递质释放

目的:探讨钙通道α3亚基基因(GABRA3)突变对人脑皮层神经元细胞凋亡、突触形成和递质释放的影响及其机制。方法:构建GABRA3基因野生型(wt-GABRA3组)和突变型(mut-GABRA3组)过表达的重组载体并将其转染到人脑皮层神经元中构建相应稳转细胞株。在机制研究中,使用转化生长因子(TGF)-β1/信号转导蛋白Sma-Mad族2(SMAD2)信号通路激活剂SRI-011381处理mut-GABRA3组细胞24 h(mut-GABRA3+SRI-011381组)。使用四唑化合物(MTS)测定法检测细胞恶性增殖能力。通过TUNEL和流式细胞术检测细胞凋亡能力。采用免疫荧光法,通过检测突触蛋白I的表达统计突触密度变化。蛋白质印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3)、Bax、TGF-β1、SMAD2、磷酸化的SMAD2(P-SMAD2)的表达。ELISA法检测神经递质乙酰胆碱的水平。结果:与wt-GABRA3组比,mut-GABRA3组细胞增殖率降低,细胞凋亡率上调,差异均有统计学意义(均P<0.05);与wt-GABRA3组比,mut-GABRA3组caspase3和Bax的表达上调,TGF-β1、P-SMAD2的表达以及乙酰胆碱的分泌水平都下调,细胞突触密度也降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与mut-GABRA3组比,mut-GABRA3+SRI-011381组细胞凋亡率、caspase3和Bax的表达均下调,而且乙酰胆碱的分泌水平和细胞突触密度都上调,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:GABRA3突变通过抑制TGF-β1/SMAD2信号通路促进人脑皮层神经元的凋亡,并抑制突触形成和递质释放。

miR-146a调控TGF-β/SMAD2信号通路对膝关节韧带损伤的影响

目的探究miR-146a调控TGF-β/SMAD2信号通路对膝关节韧带损伤的影响。方法将32只兔平均分为假手术组(只切开皮肤并缝合,但不损伤前交叉韧带)、模型组(膝关节韧带损伤后仅缝合)、安慰剂组(膝关节韧带损伤后给予生理盐水安慰剂)、miR-146 mimic组(膝关节韧带损伤后给予miR-146a mimic处理)。对模型动物进行行为能力观察和副韧带拉伸试验,通过HE染色观察兔膝关节内侧副韧带的组织变化,采用Western blot和qRT-PCR检测膝关节转化生长因子-β(TGF-β)和SMAD2的表达。结果假手术组兔膝关节可正常活动,关节软骨清晰无损坏;模型组和安慰剂组兔四肢出现疼痛现象,有明显抽搐,软骨裂痕明显严重,关节腔内液体明显增多,骨髓组织出血严重、结构紊乱;miR-146 mimic组兔关节腔内液体、骨髓组织出血及结构紊乱明显减少/轻,膝关节活动明显好转。miR-146 mimic组最大应变明显较强,且其最大位移明显较长,均优于模型组和安慰剂组(P<0.05)。Western blot分析显示,模型组和安慰剂组TGF-β和SMAD2蛋白表达明显低于假手术组(P<0.05);miR-146 mimic组TGF-β和SMAD2蛋白表达显著高于模型组和安慰剂组(P<0.05)。qRT-PCR检测结果显示,模型组及安慰剂组TGF-β和SMAD2 mRNA表达显著低于假手术组和miR-146 mimic组(P<0.05);与假手术组比较,miR-146 mimic组TGF-β和SMAD2 mRNA表达较低(P<0.05)。结论miR-146a可促进TGF-β/SMAD2蛋白表达,增强韧带拉伸效果,改善膝关节韧带的损伤。

白花丹素通过调节TGF-β1/Smad2及Nrf2/NOX4通路改善博来霉素诱导的肺纤维化

目的:探究白花丹素(plumbagi,PL)对博来霉素诱导的肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)的保护作用及其可能性机制。方法:将60只雄性C57BL/6小鼠随机分为:对照组(Control)、博来霉素组(bleomycin,BLM)、PL低剂量组(1 mg/kg)、PL高剂量组(2 mg/kg)。采用气管内注射BLM(3 mg/kg)复制小鼠PF模型,腹腔注射PL(1或2 mg/kg)3周,处死动物。HE与Masson染色观察肺组织形态学变化及胶原沉积情况。检测小鼠肺组织中超氧化物歧化酶(superoxide dis‐mutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和羟脯氨酸(hydroxy‐proline,HYP)活性或含量。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠肺组织中白介素-6(interleukin-6,IL-6)含量。免疫组化检测小鼠肺组织中核因子相关因子2(nuclear factor related factor 2,Nrf2)和NADPH氧化酶4(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)阳性细胞表达。Western blotting检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)、IL-6、转化生长因子-β_(1)(transforming growth factor-β_(1),TGF-β_(1))、p-Smad2、Nrf2和NOX4的蛋白表达。结果:与BLM组相比,PL治疗可减轻小鼠肺间质损伤及细胞外基质沉积,降低HYP含量(P<0.01,P<0.05),降低α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ的蛋白表达(P<0.01,P<0.05),减少IL-6的分泌(P<0.01),提高机体抗氧化能力(增强SOD和GSH的活性,减少MDA含量,P<0.01,P<0.05),显著下调TGF-β_(1)、p-Smad2和NOX4阳性细胞及蛋白表达(P<0.01,P<0.05),上调Nrf2阳性细胞及蛋白表达(P<0.01,P<0.05)。结论:PL可能通过调节TGF-β_(1)/Smad2及Nrf2/NOX4信号通路减轻炎症反应与胶原沉积,提高机体抗氧化能力,从而延缓PF进程。

BMP⁃2/Smad信号通路探讨金匮肾气丸对BMSCs成骨分化的影响

目的观察金匮肾气丸含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响并探讨其发生的作用机制。方法制备金匮肾气丸含药血清,CCK⁃8法筛选出最佳浓度的金匮肾气丸含药血清对BMSCs向成骨分化的影响。将BMSCs分为空白组(control组)、成骨诱导组(OIS)、空白血清组(ROIS组)及含药血清组(JKSQ⁃OIS),分别对各组BMSCs进行成骨诱导。连续干预14 d及21 d后,分别进行碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色镜下观察各组碱性磷酸酶活性和成骨矿化水平;连续干预14 d后,实时荧光定量PCR(q⁃PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测各组BMSCs中骨形态发生蛋白2(BMP⁃2)、Smad1、ALP、Runt相关转录因子2(runt⁃related transcription factor 2,Runx2)及成骨细胞特异性转录因子(Osterix,OSX)mRNA和蛋白的相对表达量。结果与control组相比,OIS组与ROIS组出现点状矿化结节,ALP染色轻微变深,ALP和Runx2 mRNA及蛋白的表达上升(P<0.05,P<0.01),OSX的表达上升但不明显(P>0.05);与OIS组相比,JKSQ⁃OIS组矿化结节成片分布,ALP染色明显加深,BMP⁃2、Smad1、ALP和Runx2 mRNA及蛋白的表达上升(P<0.05,P<0.01),OSX mRNA及蛋白表达有上升趋势(P>0.05)。结论金匮肾气丸含药血清可能通过调控BMP⁃2/Smad信号通路,上调ALP、Runx2和OSX的表达,促进BMSCs向成骨分化,改善OP。

益肾降糖饮对糖尿病肾脏病大鼠TGF-β1/SMAD2/3信号通路的调节作用

目的:观察益肾降糖饮对糖尿病肾脏病(DKD)大鼠TGF-β1/SMAD2/3信号通路的调节作用。方法:随机将30只大鼠分为对照组、模型组、益肾降糖饮低剂量组、益肾降糖饮高剂量组、达格列净组,以柠檬酸缓冲液溶解的1%链脲佐菌素(STZ)经腹腔注射建立DKD大鼠实验模型。经8w治疗后,检测并比较各实验组大鼠禁食状态下的血糖、24h尿蛋白、肾组织病理的变化,以及转化生长因子-β1(TGF-β1)/SMAD2/3信号通路、纤维粘连蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。结果:与模型组比较,益肾降糖饮低剂量组、益肾降糖饮高剂量组大鼠的肾重指数、空腹血糖、24h尿蛋白、TGF-β1、SMAD2/3、纤维粘连蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及肾纤维化程度均明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:益肾降糖饮可通过干预TGF-β1/SMAD2/3信号传导,从而延缓DKD大鼠肾纤维化的进展。

基于TGF-β1/Smad2/3信号通路探讨茴香胶囊抗支气管哮喘作用及机制

目的探讨茴香胶囊抗支气管哮喘作用及潜在机制。方法采用环磷酰胺腹腔注射法建立小鼠免疫低下模型评价茴香胶囊免疫增强作用;采用浓氨水引咳法及酚红排泄法评价茴香胶囊止咳祛痰活性;采用卵清蛋白致敏和激发方式构建支气管哮喘小鼠模型,实验过程中观察并记录小鼠体重及行为学变化;检测小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞计数;ELISA法检测免疫球蛋白E(IgE)、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-17A(IL^(-1)7A)、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平;HE和Masson染色观察肺组织病理学变化;RT-qPCR、Western blot检测TGF-β1/Smad2/3通路相关蛋白表达。结果茴香胶囊可增强免疫低下小鼠的免疫功能,延长小鼠咳嗽潜伏期,减少小鼠咳嗽次数,增加小鼠气管酚红排泌量,降低支气管哮喘小鼠BALF中白细胞等炎性细胞数量,降低IgE、IL-4、IL^(-1)7A、TGF-β1水平,增加IFN-γ水平,减轻小鼠肺组织病理学变化;下调TGF-β1/Smad2/3通路相关蛋白表达。结论茴香胶囊可能通过增强机体免疫力、止咳祛痰缓解支气管哮喘小鼠哮喘症状,调节Th1/Th2失衡、降低肺组织中炎症因子水平、下调TGF-β1/Smad2/3信号通路减少气道炎症及气道重塑。

Treg与促炎因子协同作用活化子宫内膜间质细胞Smad2信号通路

本研究探讨了异位病灶调节性T细胞(Treg)与促炎细胞因子IL-1β、TNF-α协同作用对子宫内膜间质细胞Smad2信号通路的活化作用及其分子机制。采用原代分离培养子宫内膜异位症(简称内异症)患者在位及异位子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cell,ESC);流式细胞术和ELISA法分别检测腹腔液中Treg的比例和TGF-β1的水平;免疫组织化学法分析正常、在位及异位内膜间质细胞中P-Smad2和Smad2的表达水平;细胞内Western法分析ESC Smad2信号通路的活化状况。结果显示:(1)与非内异症者相比,内异症患者盆腹腔内具有更多数量的Treg和更高水平的TGF-β1,且与疾病的进展呈正相关。(2)内异症患者在位及异位内膜具有更高的P-Smad2和Smad2水平。(3)异位病灶微环境中的Treg能够通过分泌TGF-β1与IL-1β或TNF-α发挥协同作用,可能通过激活ERK和p38信号通路活化ESC Smad2信号通路。ESC Smad2信号通路的活化可能通过多种分子机制影响ESC的生物学活性,从而导致疾病的发生和发展。

ALK4-Smad2/3信号通路在特发性肺纤维化中的作用及机制研究

目的:探讨ALK4对肺纤维化的作用及其机制。方法:野生型(ALK4^(+/+))小鼠和ALK4^(+/-)小鼠分别分为生理盐水组(对照组)及博来霉素模型组(实验组),使用HE及Masson两种染色观察肺纤维化程度,使用Western印迹检测ALK4、p-Smad2、p-Smad3及t-Smad2/3的蛋白表达水平,使用RT-qPCR检测CollagenⅠ、Fibronectin、α-SMA的mRNA表达水平,独立样本t检验统计实验数据。结果:ALK4在博来霉素诱导的肺纤维化组织中表达水平显著升高(P<0.05);低表达ALK4抑制了博来霉素诱导的肺纤维化;博来霉素诱导的肺纤维化小鼠中ALK4^(+/-)组CollagenⅠ、Fibronectin、α-SMA的mRNA表达明显低于ALK4^(+/+)组(P<0.05);博来霉素诱导的肺纤维化小鼠中ALK4^(+/-)组的p-Smad2、p-Smad3表达水平均显著低于ALK4^(+/+)组(P<0.05)。结论:下调ALK4表达可以抑制Smad2/3信号传导,进而抑制肺间质纤维化的形成,因此ALK4可能成为特发性肺纤维化的潜在治疗靶点。

异丙酚下调TGF-β1/smad2信号通路促进TGF-β1活化的NRK-49F细胞的凋亡

目的利用转化生长因子-β1(TGF-β1)活化大鼠肾成纤维细胞系NRK-49F探讨异丙酚(Propofol,PPF)调控TGF-β1/Smad 2信号通路对肾纤维化的保护作用。方法采用TGF-β1活化NRK-49F细胞的方法造成肾纤维化细胞模型。将细胞分为正常组、TGF-β1组和PPF干预组。CCK-8检测各组细胞的增殖能力;TUNEL检测各组细胞的凋亡情况;Western blot法检测各组细胞Bax、Bcl-2及caspase-3的蛋白表达;qPCR法检测各组细胞中TGF-β1和smad 2 mRNA的表达;Western blot法检测各组细胞中TGF-β1和(p-)smad 2蛋白水平的表达。结果与正常组相比,TGF-β1组细胞增殖能力明显升高,凋亡细胞数明显降低,Bax/Bcl-2比例以及cleaved caspase-3蛋白水平明显降低,TGF-β1、和(p-)smad 2 mRNA和蛋白表达水平显著升高;与TGF-β1组相比,PPF干预治疗后的TGF-β1组细胞增殖能力明显降低,凋亡细胞数明显增加,Bax/Bcl-2比例以及cleaved caspase-3蛋白水平明显升高,TGF-β1、和(p-)smad 2 mRNA和蛋白表达水平显著降低。结论 PPF抑制TGF-β1诱导NRK-49F细胞的增殖、活化并诱导其凋亡从而发挥肾保护作用,与抑制TGF-β1/Smad2信号通路相关。

益肺汤调控TGF-β1/Smad2通路抗肺纤维化机制研究

目的:研究益肺汤含药血清对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肺成纤维细胞(NIH-3T3)的影响,探讨其抑制肺纤维化的作用机制。方法:采用SPF级C57小鼠灌胃益肺汤,1次/d,连续给药3 d制备含药血清。实验分为正常对照组、模型组、模型+正常血清组、模型+含药血清组,给药48 h后0.1%FBS的培养基饥饿处理24 h,100 ng/μl的AngⅡ诱导造模24 h。免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA);免疫荧光检测Smad2;Western blot检测Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、α-SMA、纤维连接蛋白(FN)、Smad2;ELISA检测细胞上清转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达情况。结果:Western blot和免疫荧光显示,造模后,α-SMA、FN、ColⅠ、Smad2的蛋白相对表达显著升高,差异具有统计学意义(均P<0.05)。益肺汤含药血清干预48 h后造模,α-SMA、FN、Smad2、ColⅠ的相对量较模型组下降(均P<0.05)。ELISA结果显示,造模后,TGF-β1的相对表达显著升高(P<0.05),益肺汤含药血清干预48 h后,TGF-β1相对量较模型组下降(P<0.05)。结论:益肺汤含药血清对AngⅡ诱导的NIH-3T3有一定影响,可有效减轻肺纤维化,其作用机制可能与调控TGF-β1/Smad2信号通路,降低α-SMA、ColⅠ、FN的表达有关。

黄芪甲苷激活TGF-β1/Smad2信号通路诱导骨髓间充质干细胞向周细胞分化的作用研究

目的:观察黄芪甲苷促进大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)向周细胞分化的作用,揭示中药黄芪治疗缺血性心脏病的意义。方法:本研究以大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,采用全骨髓培养法,从SD大鼠乳鼠(5d-7d)股骨提取原代细胞,体外传代纯化,P4-P5代用于实验。实验分阴性对照组,大鼠BMSCs 15%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)向周细胞分化的作用,揭示中药黄芪治疗缺血性心脏病的意义。方法:本研究以大鼠骨髓间培养基培养,不给予药物干预;阳性对照组,给予转化生长因子β1(TGF-β1)5 ng/mL干预3天;黄芪甲苷(Astragaloside,Ast)组,给予黄芪甲苷4μg/mL分别干预1 d、2 d、3 d、5 d、7d;阻断剂组,TGF-β1受体阻断剂sb431542预处理后,再加入黄芪甲苷4μg/mL分别诱导1 d、2 d、3 d。实时定量PCR(RT-PCR)检测神经元-胶质细胞抗原2(Neuron-glial antigen 2,NG2)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)信使核糖核酸(mRNA)表达;印迹法(Western blot)检测NG2、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2蛋白表达。结果:经黄芪甲苷诱导刺激后,大鼠骨髓间充质干细胞在mRNA和蛋白水平上,NG2、α-SMA的表达量均升高;Ast 3d组,与阴性对照组和阳性对照组相比,NG2、α-SMA蛋白和mRNA的表达量均显著升高(p<0.05)。黄芪甲苷刺激细胞后,TGF-β1/Smad2信号传导通路被激活,从第一天开始,p-Smad2蛋白表达量升高,第3天到达顶峰,随后降低;其中第三天,p-Smad2蛋白表达量显著高于Ast 0d组(p<0.01)。加入阻断剂后,黄芪甲苷受到sb431542影响,对细胞的作用减弱,NG2、α-SMA蛋白和mRNA表达量均下调;sb431542+Ast 3d组,与Ast 3d组相比,NG2、α-SMA蛋白和mRNA的表达量显著降低(p<0.001)。受阻断剂的影响,黄芪甲苷对TGF-β1/Smad2信号传导通路的作用减弱,前三天p-Smad2蛋白的表达量均降低,sb431542+Ast 3d组,与Ast 3d组相比,p-Smad2蛋白的表达量显著降低(p<0.001)。结论:黄芪甲苷具有促进大鼠BMSCs向周细胞分化的作用,其机制与激活TGF-β1/Smad2信号传导通路相关。

基于TGF-β1/Smad2/3信号通路探究刺梨多糖缓解运动性免疫抑制发生的机制

目的:探究刺梨多糖介导转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGFβ)信号通路缓解运动性免疫抑制发生的信号转导机制。方法:SPF级SD大鼠40只,随机分为正常对照组(C组)、运动训练组(E组)、运动+小剂量刺梨多糖组(ES组)和运动+大剂量刺梨多糖刺梨组(EB组)。以递增负荷跑台训练模式建模免疫抑制大鼠模型,运动期间ES组、EB组分别以100 mg/kg和200 mg/kg的剂量灌胃刺梨多糖,C组、E组以等剂量的生理盐水灌胃,记录大鼠每周的体质量。试验结束后,取外周血和脾脏,观察脾脏组织结构病理变化、测定各组大鼠鼻腔液中分泌型免疫球蛋白(sIgA)的水平、外周血中CD4+、CD8+、INF-γ、IL-4的水平和脾脏组织中TGF-β1、TGF-β1受体2(TGF-βreceptor,TβR2)、Smad2/3的相对表达水平。结果:与C组相比,E组体质量、sIgA含量降低(P<0.01);脾脏组织结构病理变化明显;外周血CD4+含量降低(P<0.01)、CD4+/CD8+下降(P<0.05)、INF-γ/IL-4下降(P<0.01)、INF-γ、IL-4含量升高(P<0.01);组织TGF-β1蛋白表达升高(P<0.01)、Smad2/3蛋白表达降低(P<0.01)。与E组相比,ES、EB组体质量、sIgA含量增加(P<0.01);脾脏组织结构病理变化显著减少;外周血CD4+含量升高(P<0.05)、CD4+/CD8+升高(P<0.05)、INF-γ/IL-4升高(P<0.01)、INF-γ含量降低(P<0.05)、IL-4含量降低(P<0.01);组织TGF-β1蛋白表达降低(P<0.01)、Smad2/3蛋白表达水平升高(P<0.01),且组间存在量效关系。结论:刺梨多糖可介导TGF-β1/Smad2/3信号通路下调TGF-β1和上调Smad2/3蛋白的表达,促进T淋巴细胞的分化,调控T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+和细胞因子INF-γ/IL-4的稳态,缓解运动性免疫抑制的发生。