Smad3基因敲除对5/6肾切除慢性肾脏纤维化小鼠模型的影响

目的观察Smad3基因敲除对5/6肾切除慢性肾纤维化小鼠模型的影响。方法清洁级WT-C57及Smad3-KO(以下简写S3-KO)小鼠各24只,分为假手术野生组(SWT)、假手术Smad3-KO组(SS3-KO)和模型野生组(MWT)、模型Smad3-KO组(MS3-KO)4组,模型组以platt法建立慢性肾脏纤维化模型,造模后4周,检测各组小鼠血中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24h尿蛋白(U-Pro/24h)含量、病理形态学变化;免疫荧光染色法观察肾组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),I型胶原蛋白(CollageI),纤维连接蛋白(FN)的表达面积变化;蛋白免疫印迹法(WB)和实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测各组小鼠肾组织TGF-β1、p-Smad3、α-SMA、CollageI、FN蛋白及mRNA的表达水平;免疫组化法观察肾组织内中性粒细胞阳性表达个数的变化。结果与假手术组比较,MWT组P-smad3蛋白,Smad3mRNA明显增高(P<0.01),MS3-KO组虽有增高,但无显著性差异(P>0.05)。HE染色SWT,SS3-KO组肾小球形态基本正常,天狼星染色肾组织间质无或有少许红色胶原纤维沉积。MWT,MS3-KO组肾小球明显异常,天狼星染色MWT,MS3-KO组间质能够见到明显的胶原纤维,MS3-KO组病理改变总体轻于MWT组。经过图像处理分析可见,胶原纤维面积MS3-KO组面积小于MWT组,组间比较均有显著性差异(P<0.05)。指标方面,SWT与SS3-KO组比较,α-SMA、CollageI、FN免疫荧光面积,Scr、Bun、U-Pro/24h水平,TGF-β1、α-SMA、CollageI、FN蛋白和mRNA相对表达水平,中性粒细胞阳性表达个数均无显著性差异(P>0.05),M组与其S组比较上述指标含量明显增高(P<0.01或P<0.05),而MS3-KO与MWT比较,MWT组上述指标上升更为明显,组间差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论Smad3-KO能够减少模型组小鼠肾组织TGF-β1、α-SMA、FN、CollageI蛋白和mRNA的表达,改善肾功能,减少中性粒细胞的表达,能够减轻模型所致的肾脏纤维化病理损害,对肾脏损害有一定的保护作用。

Smad3基因剔除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的 为进一步深入研究Smad3基因在脊椎动物发育中的重要作用 ,对Smad3基因剔除小鼠进行保种和繁育研究。方法 采用基因剔除杂合子小鼠进行保种 ,通过PCR和Southern杂交对杂合子小鼠交配所产生的后代进行基因型鉴定 ,纯合子小鼠和野生型小鼠用于表型分析 ,杂合子小鼠用于留种和繁殖生产。结果 采用PCR方法对 2 78只子代小鼠进行了基因型鉴定 ,83只为野生型 ,133只为杂合子 ,6 2只为纯合子。结论 Smad3基因剔除突变能稳定遗传。采用杂合子小鼠保种 。

小鼠Smad3基因的克隆及其在小鼠组织中的表达

采用PCR获得的Smad3cDNA片段作为探针筛选小鼠脑cDNA文库 .克隆了小鼠全长的Smad3基因 .对小鼠Smad3基因的全编码区进行了序列测定 .结果表明 ,小鼠SMAD3与人SMAD3氨基酸同源性高达 99% .与小鼠Smad2基因相比 ,碱基同源性高达 91 8% .Northern杂交显示 ,Smad3基因在小鼠胚胎发育和各成体器官中普遍表达 .原位杂交显示 ,Smad3基因表达在小鼠胚胎期E16 5d的软骨。

Smad3基因缺失加快的小鼠皮肤创面收缩速度机制研究

目的:研究Smad3基因剔除小鼠皮肤创伤愈合速度加快的机制。方法:利用不同基因型的Smad3基因剔除小鼠及对照小鼠进行皮肤缺失型创伤试验,观察组织病理变化;分离不同基因型小鼠胚胎成纤维细胞,观察其胶原收缩能力的变化。结果:Smad3基因剔除小鼠在皮肤创伤愈合时表现出重上皮化进度快;成纤维细胞胶原收缩试验中,Smad3缺失的细胞在有血清的培养条件下胶原收缩速度快于野生型细胞,而在无血清培养条件下,有无转化生长因子β1(TGF-β1)两者变化不显著。有血清培养时Smad3缺失的成纤维细胞表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增加。结论:SMAD3通过抑制α平滑肌肌动蛋白在成纤维细胞中的表达调节成纤维细胞的收缩能力,以致Smad3缺失小鼠皮肤创面收缩速度加快。

Smad3基因剔除致骨关节炎小鼠血清蛋白质组双向凝胶电泳分析

Smad3基因剔除导致小鼠骨关节炎。为了进一步深入研究Smad3基因缺失导致骨关节炎形成的分子机制 ,寻找骨关节炎发生早期的分子变化。用双向电泳技术结合肽质量指纹谱技术对Smad3基因剔除小鼠和野生型小鼠血清蛋白质组进行了初步分析。对其中 7个表达差异蛋白质进行了鉴定 ,并探讨了所鉴定蛋白质与骨关节炎发生的关系。为揭示SMAD3介导的TGF β信号在骨骼发育中的重要作用提供了线索。

Smad3基因siRNA对TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖的影响

目的构建大鼠Smad3基因特异性siRNA沉默质粒,并探讨其在TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖中的作用。方法构建大鼠Smad3基因沉默质粒,荧光纤维镜观察转染效率,定量PCR、免疫组化法检测Smad3基因和蛋白的变化,BrdU ELISA法和EMSA法分别检测转染siRNA及联合大小剂量TGF-β1刺激后细胞增殖和Smad3结合活性变化。结果沉默质粒转染效率为41.2%,瞬时转染后具有促增殖作用且与转染剂量成正比,并使其mRNA表达下调50%、蛋白表达明显降低,还可降低大小剂量TGF-β1双向调节细胞增殖和Smad3结合活性的变化程度。结论pSUPERSmad3沉默质粒构建成功,TGF-β1可通过调节Smad3来达到双向调节成纤维细胞增殖作用。

Smad3基因剔除对小鼠肾脏功能的影响

目的 了解Smad3基因剔除对小鼠肾脏解剖特征及功能的影响。方法 常规解剖学方法及通过荷兰半自动生化仪检测有关一些肾脏功能的血清学指标。结果 不同日龄不同基因型Smad3基因剔除小鼠之间的比较 ,35日龄Cre、体重、肾脏、肾上腺差异显著 ,UA、BUN纯合型小鼠高于野生型 ,体重及脏器重量与脏器指数低于野生型 ;70日龄和 6月龄BUN、体重、肾脏重量差异显著 ,6月龄纯合型小鼠的Cre和BUN高于野生型 ,70日龄纯合型小鼠的UA高于野生型 ,而 6月龄的UA却低于野生型。纯合型小鼠在不同年龄时各项指标差异不显著 ,但Tbili、Cre、BUN在 6月龄时比较高 ,UA在 70日龄相对高。结论 Smad3基因剔除小鼠从性成熟经过体成熟到老龄阶段 ,其代谢产物存在差异 ;通过解剖学观察Smad3基因剔除小鼠 ,含有纯合基因的小鼠在生产繁殖过程 ,出现 12 5 %的单肾小鼠 ,而肾上腺尚在。说明Smad3基因剔除对小鼠肾脏的形成具有一定影响。

腺病毒载体介导Smad3基因在秦川牛前体脂肪细胞中的过表达和沉默

旨在通过在秦川牛前体脂肪细胞中过表达和沉默Smad3基因,探讨其在秦川牛前体脂肪细胞分化过程中的生物学功能,从而为阐明TGF-β信号通路在牛脂肪组织生长发育过程中发挥的作用提供理论依据。本试验采用Ad5腺病毒改建的AdMaxTM重组腺病毒包装系统成功重组获得了过表达腺病毒pDC316-EGFP-bSMAD3和干扰腺病毒pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405。感染牛前体脂肪细胞后,利用实时荧光定量检测Smad3基因及脂肪形成相关基因mRNA的表达。结果表明,将获得的具有较高滴度的过表达腺病毒pDC316-EGFP-bSMAD3感染秦川牛前体脂肪细胞3、6、9d后,分别较对照组Smad3基因表达量显著上调了1 031、1 286、633倍(P<0.001)。与对照组相比,高滴度干扰腺病毒pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405感染牛前体脂肪细胞3、6、9d后,Smad3基因的表达量分别下调了70%、55%、57%(P<0.01)。油红O染色和实时荧光定量结果均证明,Smad3基因抑制了前体脂肪细胞脂质积累并促使标志基因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的表达显著下调。综上所述,腺病毒载体介导体外表达载体可以成功的实现Smad3基因在秦川牛前体脂肪细胞中的过表达和沉默,并对秦川牛前体脂肪细胞的成脂分化具有一定的调控作用。

SMAD3基因在畜牧生产中的应用研究进展

SMAD3基因是SMADS基因家族成员之一,其编码的SMAD3蛋白是转化生长因子-β(TGF-β)超家族特异的细胞内信号转导分子,SMAD3基因通过TGF-β超家族参与疾病、免疫调节、生长发育、创伤愈合、软骨与骨骼的发育及维持等重要的生理过程,同时还参与调节生殖细胞的增殖、分化、成熟、黏附、闭锁、凋亡和甾体激素的产生等,因此,了解SMAD3基因的结构与功能对动物生长发育、繁殖等研究具有重要意义。文章简述了SMAD3基因结构、功能、作用机理,分析了其在畜牧生产方面相关的应用研究进展发现,目前SMAD3基因在畜牧生产上的应用研究主要集中在参与调控脊椎动物(猪、牛、羊、鸡等)生长、发育、细胞免疫与凋亡、激素分泌及繁殖功能方面;SMAD3基因在调控动物机体疾病发生、生长发育、脂肪沉积及繁殖性能方面仍是国内外研究的热点,而该基因对畜禽疾病发生、生长和繁殖性能的精确分子调控机制仍有待进一步研究。

Smad3基因调控食管鳞癌发生及EGCG干预研究

目的探讨Smad3基因与食管鳞癌发生及发展关系,表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)抑制食管癌细胞Ec9706增殖作用及调控Smad3基因表达水平。方法 RT-PCR方法检测44例食管鳞癌及正常食管组织中Smad3基因表达水平,流式细胞术方法检测38例原发性食管鳞癌和20例正常食管组织的细胞周期,不同浓度EGCG(0、100、200、300 mg/L)作用Ec9706细胞24、48 h后流式细胞术检测细胞增殖及Smad3蛋白表达水平。结果食管鳞癌组织中Smad3 mRNA表达水平显著低于正常食管组织中的表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。食管鳞癌组织增殖指数显著高于正常食管组织(P<0.05)。不同浓度EGCG作用Ec9706细胞24 h后,细胞增殖指数显著降低(P<0.05),而Smad3蛋白表达水平显著增高(P<0.05)。结论 Smad3在食管鳞癌中的异常表达参与了食管鳞癌发生及发展,EGCG具有抑制食管鳞癌生长作用与调控Smad3蛋白表达有关。

不同日龄Smad3基因剔除小鼠的脏器重量及脏器指数

实验选用不同年龄雌雄小鼠各 2 0只 ,剖检Smad3基因剔除小鼠 ,观察其大体解剖特征 ,测定其体重、脏器重量、脏器指数 ,统计比较结果。其结果是 35日龄Smad3基因剔除纯合型小鼠的体重及各脏器重量均低于其它两种表型 ,而心、肝、脾、胸腺的脏器指数高 ;70日龄Smad3基因剔除纯合型小鼠的体重、肝脏、脾脏、肾脏、卵巢、睾丸和附睾均低于其它两种基因型 ,而脏器指数是肝脏低 ,脾脏和胸腺高 ;Smad3基因剔除纯合型小鼠与野生型小鼠比较 ,具有其独特的特性 ,为该小鼠的应用提供一定的参考。

Smad3基因剔除小鼠的血液生理生化指标检测——35日龄Smad3基因剔除小鼠

对 35日龄的血液生理生化指标进行了检测 ,反映出日常生长繁殖中Smad3基因剔除小鼠性成熟时血液生理生化指标的变化。纯合型 (- - )小鼠的白细胞和血小板明显高于杂合型 (+ - )和野生型 (+ +)小鼠。各项生化指标三种表型之间方差分析CER、GPT、CL、CA、MC差异显著 ,其它指标均差异不显著。纯合型 (- - )的GLU、CK、UA、TG、GPT、GOT、BUN、LDH L指标高于野生型的小鼠 ;CRE、CA。

Smad3基因剔除小鼠的血液生理生化指标检测——70日龄Smad3小鼠

对成年 70日龄的Smad3基因剔除小鼠血液生理生化指标进行检测 ,结果只有少数指标雌雄之间差异显著 ,纯合型 (- - )小鼠的白细胞 (WBC)和血小板高于杂合型 (+ - )和野生型 (+ +)小鼠。各项生化指标三种表型之间方差分析CER、CK、UA、GOT、TP、ALP、LDH L、MG、CA差异显著 ;纯合型 (- - )的CK、UA、TG、ALP、LDH L指标高于野生型的小鼠 ;GLU、P、MG、CA指标低。

Smad3基因剔除小鼠6月龄的生物学特性研究

选用 6月龄Smad3基因剔除小鼠 ,称重、采血、解剖 ,检测其生理生化、体重、脏器重量及剖检的特性 ,其结果 :纯合型的MCH、CK、Tibil、GOT和LDH L ,及其肾上腺脏器指数差异显著 ;+ -的肾脏重量差异显著。不同基因型之间比较 :WBC、HCT、MCHC、GLU、CHO、ALP、BUN、LDH L和CA ,及其体重、心脏、肝脏、肾脏、胸腺的脏器指数差异显著 ,并且纯合型的WBC、HCT、CK、CRE、GPT、GOT、ALP、BUN、LDH L较野生型和杂合型小鼠高 ,MCHC、GLU、CHO、MG、CA较野生型和杂合型小鼠低 ;杂合型的GOT、野生型的CK、ALP差异显著。

Smad3基因剔除小鼠血清酶活性的变化

目的 探讨Smad3基因对剔除小鼠血清酶活性的影响。方法 采用荷兰半自动生化分析仪对 35日龄、70日龄、6月龄的三种不同基因型的小鼠的ALP、AST、ALT、CK、LDH L进行测定。结果 纯合型小鼠各项指标较野生型高 ,且表现出ALP随着年龄的增长而降低 ;AST、ALT、CK、LDH L随着年龄的增长而增高。结论 Smad3基因的剔除对小鼠的血清酶活性有一定的影响 ,为该小鼠的进一步研究提供基础。

Smad3基因剔除小鼠特异性免疫功能的研究

目的 研究Smad3基因剔除小鼠的体液免疫和细胞免疫。方法 采用流式细胞仪对其细胞免疫和体液免疫进行检测 ;并且应用ELISA方法对IgG抗体的吸光度进行测定。结果 纯合型 (- - )小鼠CD8+ 、CD4 + CD8+ 、IgG雌雄之间差异有显著性 ;CD4 + 、CD8+ 、CD3+ 、CD19+ 、IgG的值低于野生型 ;结论 CD4 + CD8+ 的比值同野生型比较属于异常 (与人的范围比较 )。因此 。

Smad3基因敲除小鼠肾Smad2和p-Smad2表达的变化

目的：观察Smad3基因敲除小鼠肾Smad2和p-Smad2表达的变化，探讨Smad3基因敲除小鼠肾是否有Smad2和p-Smad2代偿性增加。方法：4只Smad3基因敲除小鼠，10只野生型小鼠，应用免疫组织化学显色技术，检测Smad2和矿Smad2蛋白的定位和表达情况，并用Modc病理图像分析系统对图像进行半定量分析。结果：野生型小鼠肾Smad2蛋白在肾远端小管和肾集合管细胞胞质中有广泛弱表达，p-Smad2蛋白在肾远端小管和肾集合管细胞胞质、胞核中也有弱表达，而Smad3基因敲除小鼠的Smad2和p-Smad2的表达比野生型小鼠有显著升高。结论：Smad3基因敲除能引起小鼠肾Smad2和p-Smad2表达的代偿性增加。

京海黄鸡Smad3基因多态性与生长性状的相关性研究

为探讨Smad3基因作为京海黄鸡生长性状遗传标记的可能性,本研究以京海黄鸡为研究对象,采用PCR-SSCP方法对Smad3基因的第6和第7外显子进行SNPs检测,并分析其对京海黄鸡生长性状的影响。结果表明:京海黄鸡Smad3基因中有2个位点存在多态性,即第6外显子第53424碱基的T/C转换和第7外显子第54959碱基的C/G颠换,分别命名为g.T>C53424和g.C>G54959;在g.T>C53424位点形成AA和AB2种基因型,在g.C>G54959位点形成TT、TM和MM 3种基因型;AB基因型个体8周龄体重显著高于AA基因型个体(P<0.05),且AB型为优势基因型,基因型频率为0.533;而TT、TM和MM 3种基因型个体的各周龄体重差异均不显著(P>0.05)。结果提示,检测到的Smad3基因单核苷酸突变对京海黄鸡生长性状有一定影响,但不适合作为京海黄鸡生长性状的有效遗传标记。

猪miR-23a靶向调控Smad3基因表达的研究

为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P<0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P<0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P>0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。