雌核发育银鲫四种孵化酶基因全长cDNA的克隆及其特征分析

用抑制性差减杂交结合SMARTcDNA合成和RACE PCR技术 ,克隆得到雌核发育银鲫 (Carassiusauratusgibelio) 4种孵化酶基因的全长cDNA。 4种孵化酶基因分别被命名为GHE1、GHE2、GHE3、GHE4。序列分析表明 ,4种孵化酶基因cDNA的开放阅读框均为 795bp ,都编码 2 6 5个氨基酸。它们推断的编码氨基酸序列同源性在 79 6～95 1 %之间。种系分析表明 ,GHE1、GHE2、GHE3、GHE4的进化地位位于日本鳗鲡(Anguillajaponica)孵化酶和青 (Oryziaslatipes)孵化酶之间。不同发育时期胚胎的RT PCR分析表明 ,银鲫GHE1、GHE2、GHE3、GHE4 4种孵化酶基因从尾芽期到幼苗期都检测到表达 ,且GHE3和GHE4在神经胚期也检测到表达。各种组织的RT PCR表明 。

北京油鸡cDNA文库的构建及purH基因的表达

利用SMART技术构建了北京油鸡肝脏全长cDNA文库,构建的未扩增文库滴度为1.96×106pfu·mL-1,文库重组率为92.8%,插入片段长度为1.23kb,扩增文库滴度为1.64×1010pfu·mL-1。设计purH基因保守引物对该文库进行筛选,克隆了北京油鸡purH基因(GenBank登录号:EU334506),将purH基因完整开放阅读框定向插入pEGFP-N3,构建带有GFP报告基因重组表达载体pEGFP-N3-purH,将其导入北京油鸡体外培养细胞中。转染后24、48和72h,pEGFP-N3-purH转染率为10.3%～53.2%,绿色荧光均匀分布于细胞质与细胞核中。随表达量的增加,绿色荧光在细胞核中聚集成团块状或颗粒状。结果表明,构建的北京油鸡肝脏组织cDNA文库符合建库要求。