靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)基因的短发卡干扰RNA(shorthair-pinRNA,shRNA)表达载体,研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用,探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段。方法根据Genbank中大鼠PI3Kp110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10,经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板;合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列,将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cb-shRNA上,构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22αp-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA(简称SM22αe/pshRNA)和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA(简称KDRe/pshRNA);将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞,分别于转染24h、48h、72h后,采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量。结果荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较,前者细胞Pik3cbmRNA相对表达量降低更为明显,且两组均较对照组mRNA表达明显减少(P<0.05);酶切鉴定重组质粒载体SM22αe/pshRNA和KDRe/pshRNA构建成功;质粒转染细胞后,Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22αe/p质粒组较阴性对照组均有所降低,且转染24h后,SM22αe/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板,能够成功构建SM22αe/pshRNA和KDRe/pshRNA质粒载体,且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达。