沉默Smo基因对人宫颈癌HeLa细胞活力及凋亡的影响

目的:使用RNA干扰技术沉默Smoothened(Smo)基因,探讨其对宫颈癌He La细胞活力和凋亡的影响。方法:采用Smo shRNA转染宫颈癌He La细胞;采用RT-PCR和Western blot技术检测各组He La细胞Smo和转录因子Gli1的mRNA和蛋白表达;采用MTT比色法测定沉默Smo后细胞生长的情况;流式细胞术检测Smo shRNA对细胞周期和凋亡的影响。结果:与对照组比较,Smo shRNA转染细胞72 h后,Smo和Gli1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。Smo基因沉默后,He La细胞的活力明显降低,细胞明显阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率显著升高。结论:沉默Smo基因可有效抑制人宫颈癌He La细胞生长,并诱导其凋亡。

实时定量PCR检测慢性粒细胞白血病患者Shh、Smo基因的表达水平

目的建立Hedgehog信号通路功能性基因Shh和功能性受体蛋白Smo基因的定量检测方法,并分析其在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者中的表达水平。方法利用实时定量PCR检测20例CML患者和作为正常对照(8例)的健康人外周血细胞中Shh、Smo基因的表达水平,以β2微球蛋白(β2-M)基因作为内对照。结果 CML组Shh、Smo表达水平均明显高于正常对照组(P<0.05)。结论成功建立Shh、Smo基因的定量检测方法;Shh、Smo基因在CML中高表达。

藏系绵羊Smo基因的克隆测序及其功能的细胞水平验证

实验目的是构建藏系绵羊Smoothened(Smo)基因的皮肤特异表达载体和干扰载体,并探索其在毛囊细胞中的调控机制.试验从成年藏系绵羊(n=5)皮肤中克隆了Smo基因,获得的编码区长度为2342 bp,编码779个氨基酸,与绵羊预测的Smo基因在序列上高度相似;试验构建了该基因含KAP6.1启动子的皮肤特异表达载体pCDsRed2-KS和3个干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRⅠ-Ⅲ;随后转染体外培养的人毛囊内根鞘细胞(HHIRSC),获得的转染效率均在约40%,转染48 h后从HHIRSC中提取总RNA,用定量PCR检测Smo基因及Hh通路中Gli1和Gsk3β的mRNA水平.结果显示,藏系绵羊Smo基因在转染表达载体的HHIRSC中获得超表达,与对照组相比,其mRNA水平提高约5900倍,同时Gli1、Gsk3β基因的mRNA水平也表现出极显著上调(P<0.01);构建的干扰载体转染HHIRSC后,对Smo基因的沉默效率均在98%以上,同时Gli1和Gsk3β的mRNA水平极显著下调(P<0.01).本研究提示藏系绵羊Smo基因可能通过Hh通路影响毛囊细胞功能.

实时荧光定量PCR检测鼻咽癌组织中PTCH-1和SMO基因的表达

目的:检测Hedgehog信号通路基因PTCH-1和SMO在鼻咽癌(NPC)组织中的表达及其生物学意义。方法:利用实时荧光定量PCR分别检测32例鼻咽癌组织及32例鼻咽炎组织中PTCH-1和SMO基因的表达情况。根据Livak(2-△△Ct)法进行相对定量表达分析,以鼻咽炎组织为对照,计算鼻咽癌组织中PTCH-1和SMO表达水平。结果:在所检测的全部鼻咽癌组织和鼻咽炎组织中PTCH-1和SMO都有表达。与鼻咽炎组织相比,有75%(24/32)鼻咽癌组织的PTCH-1基因表达水平下调,有68.8%(22/32)鼻咽癌组织的SMO表达水平上调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。此外,有18.7%(6/32)鼻咽癌组织PTCH-1基因表达水平上调,有15.6%(5/32)鼻咽癌组织SMO基因表达水平下调,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:在鼻咽癌中SMO基因普遍具有较高的表达水平,PTCH-1基因的表达水平则相对较低,而SMO基因表达水平的上调及PTCH-1基因表达水平的下调,可引起Hedgehog信号通路在鼻咽癌中的异常激活,Hedgehog信号通路的异常激活可能与鼻咽癌的发生发展过程相关。

SMO基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对胰腺癌细胞SMO基因表达的影响

目的：Hegdehog信号通路在胰腺癌发生发展过程中发挥着重要的作用,针对其调控机制的研究将对胰腺癌发病机制的阐明奠定良好的理论基础.构建携带SMO靶向si RNA慢病毒表达载体,并证实其对胰腺癌细胞中SMO基因表达的抑制作用.方法：设计并合成3条SMO基因靶向si RNA片段,利用基因重组技术构建携带此3条片段的慢病毒表达载体并测定其滴度,构建好的慢病毒表达载体转染人胰腺癌细胞株SW1990后,采用RT-PCR法检测SMO基因的表达以筛选出效果最佳的干扰表达载体,并以此载体转染SW1990细胞后采用Western blot法检测SMO蛋白表达.结果：基因测序与酶切电泳结果提示成功合成SMO靶向siRNA片段且其正确插入慢病毒表达载体,无碱基缺失错排与突变,测定病毒滴度分别为5.31×10~8TU/m L,1.49×10~9TU/m L及8.50×10~8TU/m L,经转染SW1990细胞后,测定对SMO基因表达的抑制率分别为86.00%、74.85%及19.22%,效果最优的干扰表达载体转染SW1990细胞后对SMO蛋白表达的抑制率〉80%.结论：成功构建携带SMO基因靶向si RNA的慢病毒表达载体,且该载体可有效抑制胰腺癌细胞中SMO基因的表达,为进一步的研究提供了良好的实验工具.

SMO基因突变在成釉细胞瘤中的研究进展

SMO基因编码的蛋白质SMO是sonic hedgehog(SHH)信号通路中至关重要的信号转换器。SHH信号通路与多种人类肿瘤的发生、发展密切相关,异常激活的SHH信号通路通过影响细胞的增殖、分化和凋亡,导致肿瘤发生。研究发现在成釉细胞瘤中,SMO基因是除BRAF基因之外第二常见突变的基因,其较高的突变率使得SMO基因成为成釉细胞瘤分子病理研究领域中的热点。现在已有大量的研究证实,SMO基因突变与成釉细胞瘤的临床特征(如发病部位、组织学、年龄和预后等)有关,这些研究结果为成釉细胞瘤的靶向治疗提供了新的治疗思路,本文就SMO基因突变在成釉细胞瘤中的研究进展及其潜在的临床意义进行综述。

Hedgehog信号通路基因Shh、Ptch1、Smo及Gli1在胰腺癌中的表达及意义

目的:检测Hedgehog信号通路基因Sonic Hedgehog(Shh)、Patched1(Ptch1)、Smoothened(Smo)及神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1(glioma-associated oncogene homolog 1,Gli1)在胰腺癌组织中的表达及其生物学意义.方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测48例胰腺癌组织和配对的癌旁组织中Shh、Ptch1、Smo及Gli1 mRNA的表达情况.结果:RT-PCR检测结果显示:Shh、Ptch1、Smo及Gli1 mRNA在胰腺癌组织中的相对表达量分别是0.652±0.036、0.604±0.063、0.493±0.011、0.512±0.052,在胰腺癌旁组织中为0.312±0.013、0.319±0.053、0.214±0.046、0.247±0.059(P<0.05).与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中Shh、Ptch1、Smo及Gli1 mRNA表达量显著升高(P<0.05),胰腺癌组织中Shh、Ptch1、Smo及G l i1mRNA表达与胰腺癌的分化程度有显著性差异(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移、糖链抗原(CA19-9)无显著性差异(P>0.05).结论:Hedgehog信号通路基因Shh、Ptch1、S m o及G l i1在胰腺癌组织中表达增高,Hedgehog信号通路的异常激活可能与胰腺癌发生发展过程相关.

Cx43与Smo基因在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的：研究细胞间隙连接蛋白43（Cx43）与信号通路基因Smoothened（Smo）在胰腺癌中的表达及其临床意义。方法：选择从2013年1月-2015年12月在医院接受手术治疗的胰腺癌患者53例切除组织及与癌组织相配对的3cm外癌旁组织，对比不同胰腺组织中Cx43与Smo阳性表达率，及Cx43 mRNA与Smo mRNA表达水平，分析胰腺癌组织中Cx43和Smo表达与胰腺癌的病理特征之间的关系及两者的相关性。结果：胰腺癌组织中Cx43的阳性表达率及Cx43 mRNA表达水平明显低于在癌旁组织，而Smo的阳性表达率及Smo mRNA表达水平明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。胰腺癌患者组织学分级为Ⅲ级、有淋巴结转移者的Cx43mRNA表达水平分别明显低于Ⅰ～Ⅱ级、无淋巴结转移者，Smo mRNA表达水平则明显高于I～II级、无淋巴结转移者，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。Pearson相关性分析结果发现，胰腺癌组织中Cx43 mRNA和Smo mRNA表达呈负相关关系（r=-0．846，P=0．000）。结论：Cx43 mRNA在胰腺癌中的表达下降，而Smo mRNA则表达上调，临床监测Cx43及Smo基因的表达情况，有助于评价患者的病情与预后。

牙源性角化囊肿SMO基因突变检测

目的检测牙源性角化囊肿(odontogenic keratocyst,OKC)是否存在SMO基因突变,进一步完善对OKC发病机制的认识。方法收集2012年9月至2017年6月就诊于北京大学口腔医学院·口腔医院口腔颌面外科的OKC患者,10例为痣样基底细胞癌综合征性OKC(女性4例,男性6例),20例为散发性OKC(女性7例,男性13例)。采集患者的病变组织,分离衬里上皮和纤维间质,采用Sanger测序法分别检测上皮与间质DNA中SMO基因突变情况。结果检测发现3个SMO基因突变位点,即1例综合征性OKC携带c.2081C>G(p.P694R)突变,2例散发性OKC分别携带c.907C>T(p.L303F)突变和c.1247_1248delinsAA(p.G416E)突变,前2例突变为未被报道过的SMO新突变,且2例散发性OKC均不伴PTCH1突变。结论除PTCH1突变外,OKC还存在SMO基因突变,可能与OKC的发病机制有关。

玉米器官大小相关基因SMO2的鉴定和特征分析

利用生物信息学方法,从玉米基因组中鉴定出一个与拟南芥的SMO2基因同源的基因,并对这个基因的染色体分布、遗传进化、顺式调控元件等进行了分析,以期为该基因的克隆及功能研究提供有益信息。

SMO特异性siRNA慢病毒载体的筛选构建

目的构建特异性沉默SMO基因的重组慢病毒载体,筛选对T293细胞SMO基因表达抑制效率最高的siRNA。方法根据SMO基因信息,设计了4个小干扰序列和1个阴性对照序列,利用慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP构建了5个重组质粒。用脂质体将重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blot检测沉默效率,从中筛选沉默效率高的质粒载体进行慢病毒颗粒大量包装。结果测序结果证明4个重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-721、pGCSIL-GFP-722、pGCSIL-GFP-723、pGCSIL-GFP-724的插入序列完全正确,重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blotting证实重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-723的干扰效率最高。包装获得Lv-SIL-SMO723慢病毒颗粒。结论成功筛选获得特异性抑制SMO的siRNA,成功构建了特异性沉默SMO基因慢病毒载体,其产生的慢病毒颗粒能高效特异地沉默SMO基因,为进一步应用奠定基础。

靶向抑制Molt-4 T细胞增殖的Smo-siRNA:筛选和评价

背景:研究表明,T淋巴细胞白血病的发生发展与Hedgehog通路的异常有关。Smo基因是该信号通路中的关键基因,控制着Hedgehog信号向细胞膜内的传递。目的:筛选一种可以高效抑制Molt-4细胞株增殖和诱导凋亡的小干扰RNA(Smo-siRNA)。方法:(1)根据siRNA设计原理,设计并化学合成Smo-siRNA 1,2,3以及无关干扰序列的阴性对照siRNA;(2)利用Nuclefector^(TM)核转染仪将以上Smo-siRNA分别转入人T淋巴细胞白血病细胞株(Molt-4细胞),分别在转染24,48,72 h采用qRT-PCR检测Smo mRNA相对表达水平,CCK-8法检测细胞生长抑制率,Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态,流式细胞仪(Annexin V/PI法)检测细胞凋亡率。结果与结论:(1)利用Nuclefector^(TM)核转染仪成功将Smo-siRNA转入Molt-4细胞,Smo-siRNA 1沉默效果最佳,有效降低Molt-4细胞Smo mRNA表达水平(P<0.05),并且以48 h作用效果最明显;(2)转染后24 h,Smo-siRNA可明显抑制Molt-4细胞生长(P<0.05);(3)Hoechst染色证实Molt-4细胞符合凋亡的细胞形态学变化;(4)与对照组比较,Smo-siRNA1组细胞的凋亡率明显增加(P<0.05);(5)结果表明,小干扰RNA下调Molt-4细胞Smo基因表达可明显抑制Molt-4细胞增殖,并促进凋亡,提示Smo-siRNA具有作为T细胞白血病靶向基因治疗或者协同治疗的潜能。

Smo小干扰RNA对人食管癌CAES-17细胞凋亡的影响

目的:探讨Smoothened(Smo)小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对食管癌的CAES-17细胞的凋亡及凋亡相关基因Bcl-2表达的影响.方法:Smo siRNA转染食管癌CAES-17细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组食管癌CAES-17细胞中Smo、Bcl-2 mRNA的表达;采用Western blot检测各组食管癌CAES-17细胞中Smo、Bcl-2的蛋白表达;采用TUNEL及流式细胞术检测CAES-17细胞的凋亡情况.结果:与各对照组相比,Smo siRNA转染细胞24、48和72 h Smo、Bcl-2蛋白及mRNA的表达均明显降低,其中Smo siRNA的mRNA转录水平为0.524±0.011、0.422±0.008和0.332±0.019;Bcl-2 mRNA的转录水平为0.571±0.024、0.512±0.017和0.492±0.011,具有明显下调(P<0.05);转染72 h后,Smo siRNA和Bcl-2蛋白翻译水平与对照相比,分别为0.330±0.016和0.391±0.019,差异均有显著性(P<0.05);各实验组凋亡细胞数与对照组相比均明显增多(P<0.05).结论:Smo siRNA可能通过抑制CAES-17细胞中Smo基因表达,进而下调Bcl-2表达,促进CAES-17细胞凋亡.

微小RNA-433-3p靶向滑蛋白调控胰腺癌PANC-1细胞恶性生物学行为的研究

目的探讨微小RNA-433-3p(miR-433-3p)对胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响及其与滑蛋白(SMO)的靶向关系。方法培养胰腺癌PANC-1细胞、人正常胰腺上皮细胞HPNE。将miR-NC、miR-433-3p mimics、si-NC、si-miR-433-3p、敲低空载Scramble、si-SMO、Vector、SMO过表达(OE-SMO)质粒分别转染至PANC-1细胞,设为miR-NC组、miR-433-3p组、si-NC组、si-miR-433-3p组、Scramble组、si-SMO组、Vector组及SMO组。将Vector、OE-SMO质粒分别转染至miR-433-3p组细胞,设为si-miR-433-3p+Scramble组、si-miR-433-3p+si-SMO组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力,荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞SMO基因mRNA及miR-433-3p表达水平,Western blot检测细胞SMO蛋白表达水平,TargetScan在线网站预测miR-433-3p与SMO结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证miR-433-3p与SMO的靶向关系。结果PANC-1细胞SMO基因mRNA及其蛋白表达水平高于HPNE细胞,差异有统计学意义(P<0.05);PANC-1细胞miR-433-3p表达水平低于HPNE细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。下调miR-433-3p、上调SMO可促进细胞的增殖、侵袭及迁移,上调miR-433-3p、沉默SMO可抑制细胞的增殖、侵袭及迁移。下调SMO逆转了miR-433-3p低表达对细胞增殖、侵袭及迁移的促进作用。miR-433-3p可负性调控SMO表达。结论miR-433-3p负性调控SMO抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移。

Hh信号通路特异性抑制剂环靶胺对胃癌细胞侵袭转移的影响及其机制探讨

目的观察Hedgehog(Hh)信号通路特异性抑制剂环靶胺对人胃癌细胞侵袭转移的影响,并探讨其机制。方法用不同浓度的环靶胺处理人胃癌细胞MGC-803,MTT法检测细胞的增殖能力,Transwell小室观察细胞的迁移、侵袭等转移能力,qRT-PCR法检测Hh信通路相关蛋白Smo、Gli-1和转移相关因子基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA表达,Western blotting法检测Gli-1、MMP-9蛋白表达。结果随着环靶胺浓度的增加和作用时间的延长,胃癌细胞增殖抑制率逐渐增加(P均<0.05);环靶胺处理胃癌细胞24 h,40μmol/L处理的细胞侵袭和转移的穿膜细胞数均少于0μmol/L(P均<0.05),40μmol/L处理的细胞Gli-1、Smo、MMP-9 mRNA相对表达量均低于0μmol/L(P均<0.05),40μmol/L处理的细胞Gli-1、MMP-9蛋白相对表达量均低于0μmol/L(P均<0.05)。结论环靶胺能通过抑制Hh信号通路下调MMP-9表达,从而抑制胃癌细胞MGC-803的侵袭和转移。

胶质瘤相关Hedgehog信号通路的研究进展

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,传统治疗主要包括肿瘤切除、放疗及化疗,但肿瘤侵袭性强,术后复发率高。Hedgehog这一高度保守的细胞信号传导通路,广泛参与胚胎的发育和多种病理生理过程,且许多研究已证实该通路在较高比例的胶质瘤中异常活化,在肿瘤发生、发展中的作用也逐渐揭示。这为研究胶质瘤的发病机制及诊断治疗提供新的思路。本文就Hedgehog通路在胶质瘤中的研究进展进行综述。

Smo小干扰RNA对人食管癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响

目的通过Smoothened（Smo）基因位点阻断Hh信号通路抑制食管癌细胞增殖，并诱导其凋亡。方法运用Smo小干扰RNA（siRNA）转染食管癌EC9706细胞，采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和Westernblot技术检测各组细胞Smo和GlilmRNA及蛋白表达，并以噻唑蓝（M1Tr）法和流式细胞术检测SmosiRNA对细胞增殖及凋亡的影响。结果（1）SmosiRNA转染细胞24、48和72h后，SmomRNA相对表达量分别为4．20±1．10、2．80±1．10和1．00±0．71；GlilmRNA相对表达量分别为4．60±1．34、3．00±0．71和1．20±1．10，与各对照组比较均明显降低（P〈0．05）；（2）SmosiRNA转染细胞72h后，Smo和Glil蛋白相对表达水平分别为0．330±0．016和0．324±0．021，与各对照组比较均明显下降（P〈0．05）；（3）SmosiRNA转染细胞72h后，细胞生长抑制率为（88．06±7．56）％，明显高于各对照组，并随转染时间延长抑制率升高（P〈0．05）；（4）SmosiRNA转染细胞72h后，早期凋亡细胞所占的比例均明显增高。结论Smo基因具有调控食管癌细胞增殖和凋亡的作用。

Curry-Jones综合征1例国内首报

患儿男,3岁6个月,生后即发现多发带状分布的白色斑疹,随身体等比例生长,无自觉症状,伴右手拇指畸形及右手活动障碍。患儿平素不喜与人交流,注意力较同龄儿童差。否认家族史。体检:神志清,精神可,语言表达欠佳;特殊面容,右手拇指关节较左侧略膨大;心、肺、腹未见异常。皮肤科检查:右胸部、右上肢屈侧、下腹正中线及右下肢可见大小不等的多发片状、带状不规则白色斑疹,部分斑疹融合,大致沿Blaschko线分布,局部略隆起;右手掌、拇指桡侧可见条带状褐色斑。下肢白斑皮损组织病理检查示基底样毛囊错构瘤。头颅磁共振成像提示胼胝体发育不全。患儿病变组织全外显子测序显示SMO基因突变c.1234C>T(p.L412F),父母均无该位点突变。根据皮损表现、病理及基因检测结果,该患儿诊断为Curry-Jones综合征,SMO基因突变c.1234C>T(p.L412F)可能是其致病原因。予患儿右手拇指功能锻炼并密切随访。