肝癌肿瘤抗原SMP—30融合蛋白的表达及纯化

用两种不同的表达载体构建、表达人肝癌肿瘤抗啄——衰老标记蛋白-30(SMP—30),并在体外对其表达产物进行纯化和鉴定。PCR方法扩增经SEREX技术筛选出的人肝细胞癌抗原SMP—30羧基末端165个AA的DNA序列,分别与pMAL—C2和pET16b两种表达载体重组后转入相应的宿主菌中诱导表达,并对表达产物进行分离纯化和鉴定。结果克隆的SMP—30基因经DNA测序与已公布的序列相同。pMAL—C2和pET16b两种重组载体分别表达出带麦芽糖结合蛋白和带10个组氨酸的SMP—30融合蛋白,麦芽糖结合蛋白——SMP—30是以可溶性蛋白形式表达,而带组氨酸的SMP—30则以包涵体的形式存在,对表达蛋白质N-末端15个氨基酸进行测序,结果与预期的完全相同。结果说明pMAL—C2表达载体更为适合于SMP—30蛋白质的表达;实验为肿瘤抗原免疫研究打下了基础。

家蚕30kDa载脂蛋白19G1前体的生物信息学分析及克隆表达

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条编码低分子量30 kDa载脂蛋白19G1前体(lowmolecular mass 30 kDa lipoprotein 19G1 precursor)的EST序列(GeneBank登录号:AY568957),在NCBI数据库中比对后得知该基因的ORF长为771 bp,与基因组比对后发现该基因的ORF不含内含子,由单一外显子编码256个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白属于家蚕30K蛋白家族,预测分子量约为29.5 kDa,等点电为7.29;信号肽分析显示该蛋白很可能存在信号肽。根据该基因ORF进行引物设计,以家蚕基因组为模板,PCR扩增获得该基因,将其克隆到pET-28a(+)载体中并导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,裂解菌作SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白前体成功表达,为研究其功能打下了基础。

梨小食心虫化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及原核表达

为了研究梨小食心虫Grapholita molesta化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在化学感受系统中的作用,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆到一条梨小食心虫化学感受蛋白的全长cDNA序列,命名为GmolCSP(GenBank登录号:JQ821389)。序列分析表明,GmolCSP开放阅读框序列为384bp,编码127个氨基酸残基,预测N末端含有18个氨基酸组成的信号肽序列,其成熟蛋白的预测分子量为12.80kD,等电点为8.33。该基因编码的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫化学感受蛋白的氨基酸序列具有较高同源性。RT-PCR结果显示,GmolCSP在梨小食心虫成虫触角、去触角的头、胸、腹、足和翅中都有表达。将GmolCSP重组到表达载体pET-32a中,转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)进行表达。SDS-PAGE和Western印迹检测结果显示,梨小食心虫化学感受蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出一个分子量约为29kD的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小一致。本研究结果为进一步研究该蛋白的分子结构和功能奠定了良好基础。

精子蛋白17在上皮性卵巢癌中的异常表达

目的:探讨精子蛋白17(sperm pro-tein17,Sp17)在各类卵巢恶性肿瘤中的表达谱,并分析其意义。方法:用免疫组化技术检测65例卵巢恶性肿瘤组织标本Sp17的表达。结果:41例原发上皮性卵巢癌组织切片,18例不同程度地显示Sp17的异常表达,阳性率为43·9%;免疫细胞化学染色还在卵巢癌患者腹水中发现Sp17阳性癌细胞。7例卵巢原发的非上皮性恶性肿瘤和17例卵巢转移癌组织切片(原发癌来源于胃、结肠、输卵管、胆囊和肺等器官),免疫组化染色均未检出Sp17。结论:Sp17在原发上皮性卵巢癌中常见蛋白质水平的异常表达,在其他卵巢恶性肿瘤中未见表达,有可能作为上皮性卵巢癌新的诊断标志和免疫治疗靶标。

大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定

目的 :克隆大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位 (L TB)及霍乱弧菌肠毒素 B亚单位 (CTB)基因 ,构建其表达载体。方法 :采用高保真 PCR分别从 E.coli4 4 815株与 V.cholerae东 74株基因组 DNA中扩增 L TB与 CTB基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列。分别构建 p ET32 a的 LTB及 CTB表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达。采用 SDS- PAGE及 GM1- EL ISA鉴定表达产物。结果 :所克隆的 LTB和 CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 98.5 4 %～ 99.4 2 % ,氨基酸序列同源性分别高达 97.5 8%～99.19%和 96.77%～ 99.19%。p ET32 a- L TB- BL2 1DE3和 p ET32 a- CTB- BL2 1DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的 30 %和 10 %左右。GM1- EL ISA结果证实 LTB及 CTB融合蛋白均能与牛 GM1结合。结论 :本研究成功地构建了 LTB与 CTB表达系统 ,所表达的 L TB与 CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。

小麦品种陕253低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达

利用LMW-GS特异引物,从强筋小麦品种陕253中克隆了1个1498bp的片段(GenBank登录号为FJ172533),该片段包含全长为912bp的低分子量谷蛋白亚基的完整编码序列。经比较推导氨基酸序列的同源性,发现该基因属于Glu-D3位点编码低分子量谷蛋白亚基的基因,编码产物N-端具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征,系统演化分析也支持这一结果。构建了该基因的表达载体pET32a-GluD3-S253,在宿主菌E.coli Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白。SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,证实融合蛋白表达成功。

人乳头瘤病毒(地方株)16型E7蛋白的抗原性和免疫原性研究

以融合蛋白包含体形式在大肠杆菌中高效表达了人乳头瘤病毒１６型（湖北株）Ｅ７基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）。用蛋白质印迹技术（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）对该基因表达产物ＨＢＥ７融合蛋白的性质进行了鉴定。发现ＨＢＥ７融合蛋白能与ＨＰＶ１６Ｅ７单克隆抗体结合，表明该融合蛋白至少部分保留了Ｅ７蛋白的抗原特性。因此，将该融合蛋白免疫小鼠。３ｗｋ后，在小鼠血清中既检测到了抗载体蛋白的抗体，又检测到了特异性抗ＨＢＥ７抗体。实验表明：ＨＢＥ７不仅能与Ｅ７抗体产生反应，具有反应原性，而且在动物免疫中产生特异性抗体。

新城疫病毒F_(48)E_(8)株融合蛋白基因的克隆

以提纯的我国标准ＮＤＶＦ４８Ｅ８强毒株基因组ＲＮＡ为模板、化学合成的融合蛋白（Ｆ）基因特异寡核苷酸为引物，反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ，并采用同聚物加尾的方法克隆到细菌质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（－）。经ＡＩＸ平板筛选和酶切分析，并用Ｆ基因片段核酸探针作ｄｏｔ－ｂｌｏｔ检测，共获得插入片段长度在０．６～２．８ｋｂ之间的阳性克隆３４个，其中插入片段大于１．５ｋｂ的阳性克隆８个。用多种限制性内切酶对阳性克隆ｐＦ７（１．８ｋｂ）作酶切分析，其结果与国外报道的几株Ｆ基因相符。

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆。其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功。提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定。结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV16L1抗体发生特异性反应。结论:HPV16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的 :为制备重组人CD15 4-谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)融合蛋白 (hCD15 4-GST) ,用于人CD15 4单克隆抗体研制。方法 :根据人CD15 4基因序列设计合成特异性引物 ,RT -PCR扩增人CD15 4基因 ,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX - 4T - 1中 ,得到重组表达质粒pGEX - 4T - 1/CD15 4;用此重组质粒转化大肠杆菌BL2 1细胞 ,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD15 4蛋白 ,SDS -PAGE电泳鉴定表达产物。结果 :从人外周血淋巴细胞扩增出 82 0bp的hCD15 4cDNA ;将其克隆至pGEX - 4T - 1质粒中 ,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因 ;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS -PAGE电泳鉴定出现明显的 5 5kD蛋白带。结论 :成功构建了人CD15 4-GST原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中表达出人CD15 4-GST融合蛋白 ,为人CD15

鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3′端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因 (F基固 )cDNA序列 ,设计并合成了 1对引物 ,以分离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97 1株的核酸 (RNA)为模板 ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)对其融合蛋白基因 3′端进行扩增 ,获得了预计的 884bp左右的片段。将该片段克隆进 pGEM TEasy质粒载体 ,获得重组质粒T GPMVF3′ ,采用限制性内切酶和PCR方法对该重组质粒进行鉴定 ,证明所克隆的片段即为目的基因片段 。

幽门螺杆菌临床菌株hpaA基因的克隆和表达及鉴定

目的 :克隆幽门螺杆菌 (Hp) hpa A基因 ,构建 hpa A基因表达载体 ,鉴定其表达的融合蛋白免疫性。方法 :采用高保真 PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株 Y0 6中扩增 hpa A基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列 ,构建p ET32 a的 hpa A表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达 ,采用 Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果 :所克隆的 hpa A基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 .2 5 %～ 97.32 % ,氨基酸序列同源性高达 95 .38%～ 98.4 6%。p ET32 a- hpa A- BL2 1DE3系统的Hpa A融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的 4 0 %左右。Hpa A融合蛋白能与 Hp全菌抗体发生结合反应 ,免疫家兔能获得高效价抗体。结论 :本研究成功地构建了 Hp hpa A高效表达系统 ,所表达的 Hpa A融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性 ,可作为 Hp疫苗的抗原。

人Aβ_(42)重组抗原的融合表达及Aβ抗体的检测

目的原核表达β-淀粉样蛋白(Aβ42)抗原,建立检测Aβ抗体的间接ELISA技术。方法化学合成Aβ42基因两个互补片段,通过PCR构建人Aβ42基因,克隆至pGEX-2T表达载体中,原核表达并亲和纯化GST-Aβ42融合蛋白。Westernblotting检测其抗原特异性。以GST-Aβ42和Aβ42肽分别为包被抗原,间接ELISA法检测Aβ42免疫的大鼠血清中Aβ抗体。结果原核表达的可溶性GST-Aβ42融合蛋白相对分子质量为31000,经亲和纯化后,融合蛋白产量为800mg/L菌液,纯度大于95%;Westernblotting证实纯化的融合抗原与Aβ单抗特异反应;以GST-Aβ42为包被抗原,间接ELISA法检测Aβ抗体灵敏度为2ng/ml;以GST-Aβ42和化学合成的Aβ42分别为包被抗原,间接ELISA法检测Aβ42肽免疫大鼠血清中Aβ抗体滴度,两者比较差异无显著性(P>0.05)。结论原核表达的GST-Aβ42融合蛋白可替代昂贵的化学合成的Aβ42肽抗原,用于检测Aβ抗体。

CD40-IgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建人CD40-IgG1Fc融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1(+),并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达。方法应用T-A克隆技术和亚克隆技术,构建人CD40膜外段和IgG1Fc段融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1(+),将其转染入CHO细胞株并筛选,进行稳定表达。通过RT-PCR、Western blot法及ELISA法证实融合基因的表达。结果成功构建真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1(+),并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论通过基因工程生产的人CD40-IgG1Fc融合蛋白,能够特异性阻断CD40-CD40L的相互作用。

幽门螺杆菌临床菌株flaB基因的克隆和表达及鉴定

目的 :克隆幽门螺杆菌 (Hp)鞭毛素 B基因 (fla B) ,构建其原核表达系统 ,鉴定融合蛋白免疫性。方法 :采用高保真 PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株 Y0 6中扩增 fla B基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 p ET32 a的fla B表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达 ,采用 Hp全菌抗体的 Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。 ELISA检测 12 5例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中 Fla B抗体和 4 1株 Hp临床菌株 Fla B表达。结果 :所克隆的 fla B基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.31%～ 97.73% ,氨基酸序列同源性高达 99.4 1%～ 10 0 .0 0 %。p ET32 a- fla B- BL2 1DE3系统的 Fla B融合蛋白表达量为细菌总蛋白的 4 0 %左右。Fla B融合蛋白能与 Hp全菌抗体发生结合反应 ,免疫家兔能获得高效价抗体。结论 :本研究成功地构建了 Hp fla B高效原核表达系统 ,所表达的 Fla B融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性 ;Hp临床菌株 Fla B表达率高 ,且能刺激机体产生抗体。Fla B可作为 Hp疫苗及诊断试剂盒的抗原。

慢性髓系白血病bcrabl融合基因在真核细胞中的表达

克隆慢性髓系白血病 (CML)融合基因bcr abl融合位点周围的cDNA序列 ,构建重组真核表达载体并表达于 p815细胞 ,探索bcr abl基因免疫治疗CML的可行性。设计两条引物扩增bcr abl融合位点周围 46 8bp的cDNA ,测序正确后 ,将其克隆至真核表达载体pcDNA 3.1,通过电穿孔法转染至 p815细胞中 ,应用G418筛选阳性细胞克隆 ,在含 10 %FCS的RPMI16 40中常规培养 ,收集细胞进行RT PCR鉴定。结果PCR扩增出了可用于基因免疫的位于bcr abl融合基因位点周围的 46 8bp的cDNA ,序列测定除第 44 8位碱基C突变为T外其余序列均正确 ;构建了重组真核表达载体 ,并用电穿孔法将其转染 p815细胞 ,RT PCR法检测到该细胞系有bcr

一种灵敏检测慢性粒细胞性白血病融合基因的方法:RT-nested-PCR

应用RT nested PCR方法检测 15例慢性粒细胞性白血病患者的融合基因bcr/abl,检出率高达 93%。此方法是当前检测慢性粒细胞性白血病残留细胞较灵敏、较可靠的方法。

幽门螺杆菌临床菌株尿素酶B亚单位原核表达系统的构建及其重组蛋白免疫性的鉴定

目的 :克隆幽门螺杆菌 (Hp) ure B基因并构建其原核表达系统。方法 :采用高保真 PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株 Y0 6中扩增 ure B基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 p ET32 a的 ure B表达载体 ,在 E.coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达 ,采用 Hp全菌抗体的 Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果 :所克隆的 ure B基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 96.88%～ 97.82 % ,氨基酸序列同源性高达 99.65 %～ 99.82 %。p ET32 a- ure B- BL2 1DE3系统的 Ure B融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的4 0 %左右。Ure B融合蛋白能与 Hp全菌抗体发生结合反应 ,免疫家兔能获得高效价抗体。结论 :本研究成功地构建了 Hp ure B高效表达系统 ,所表达的 Ure B融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性 ,可作为 Hp疫苗的抗原。

重组猪生长抑素的基因克隆、表达与纯化

目的:在大肠杆菌中克隆表达猪重组生长抑素基因,并进行纯化和鉴定.方法:根据GenBank公布的猪生长抑素基因序列,按照大肠杆菌偏爱密码子设计并合成2条DNA单链,退火后获得猪生长抑素基因序列.克隆至原核表达载体pGEX-4T-1质粒中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白并用GST亲和柱对其进行纯化.结果:重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定证明基因完全正确,经IPTG诱导后在大肠杆菌DH5α中得到高水平表达,表达产物经超声和溶菌酶破碎和Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化获得重组蛋白.结论:猪生长抑素基因得到了高水平表达,纯化后纯度达到95%以上,为表达产物的大量制备、重组疫苗的进一步优化及在畜牧业生产上的应用研究奠定了基础.

EGF-IL-18在毕赤酵母中的表达

目的:在甲醇营养型毕赤酵母表达系统中分泌表达人表皮生长因子受体干扰基序和白细胞介素-18(EGF-IL-18)融合蛋白。方法:PCR扩增EGF-IL-18基因,克隆到表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后用电转化导入毕赤酵母GS115,筛选重组子,经摇瓶培养,用甲醇诱导表达EGF-IL-18融合蛋白。结果:序列分析表明,克隆到pPIC9K载体中的EGF-IL-18基因与设计相符,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物EGF-IL-18以可溶性分子存在于酵母培养基中,Western印记表明表达产物EGF-IL-18具有良好的抗原性。结论:重组蛋白EGF-IL-18在毕赤酵母GS115中成功分泌表达。