Variation in the Coat Protein Gene of Papaya ringspot Virus Isolates from Multiple Locations of China

The potyvirus Papaya ringspot virus （PRSV） is an important pathogen of papaya that causes severe losses in economic crops for papaya production globally. The coat protein （CP） genes of five PRSV isolates originating from different locations in China were cloned and sequenced. The CP-coding region varied in size from 864-873 nucleotides, encoding proteins of 288-291 amino acids. The five Chinese isolates of PRSV have been characterized as papaya-infecting （PRSV-P）. The CP sequences of the Chinese isolates were compared with those of previously published PRSV isolates originating from different countries at amino acid levels. A number of KE repeat boxes in the N terminus of the PRSV-CP were found in all Chinese isolates. The phylogenetic branching pattern revealed that there was certain extended grouping between geographic locations, and the Asian type probably represents the oldest population of PRSV. The information of CP genes will be useful in designing and developing durable virus resistant-PRSV transgenic papaya in China. Meanwhile broad-spectrum-virus resistant, strongly resistant-PRSV and good safe papaya lines are required.

河北省马铃薯Y病毒株系分子鉴定及其RT-PCR检测

根据马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染PVY的马铃薯田间病叶组织中提取出病毒的RNA,进行cDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约800bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的基因片段大小一致,本试验建立了快速、灵敏、简便的PVY检测的方法。将RT-PCR扩增产物克隆到质粒pGEM-T上,并进行了序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸组成的理论分子量为29kD蛋白,与PVY外壳蛋白的大小一致,与基因库登记的代表性株系相比,它们之间的核苷酸序列同源性为89 6%～98 8%,氨基酸序列的同源性为93 3%～98 5%,说明PVYCP基因具有高度的保守性(记为PVY-HBEI),与国内报道的PVY-CHU、PVY-ZHJ和PVY-ZHOU株系的氨基酸序列同源性分别为96 6%、98 5%和97 8%,与PVYN和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93 6%和97 8%,从分子水平上确定PVY-HBEI归属于普通株系(PVYO株系)。

中国大菱鲆虹彩病毒主要衣壳蛋白基因的PCR扩增及序列分析

应用同源PCR技术,从被一种球状病毒感染的患病大菱鲆(Scophthalmus maximus)脾脏和肾脏组织中扩增出了一段长度为620 bp的DNA片断.序列测定和Blast分析表明,该DNA片断与鱼类虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)C末端编码区的DNA序列高度相似,由此证实感染养殖大菱鲆的这种球状病毒为一种鱼类虹彩病毒,暂命名为大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV).多序列比对和分析发现,TRBIV MCP C末端的205个氨基酸序列与GenBank中20种虹彩病毒相应序列的相似性分别为99.47%(韩国大菱鲆虹彩病毒)、97%～98%(待指定病毒属的7种病毒),以及50%以下(蛙病毒属、淋巴囊肿病毒属、虹彩病毒属的12种病毒),由此绘制出了包含TRBIV在内的21种虹彩病毒的系统发育树.研究结果表明,感染中国养殖大菱鲆的TRBIV属于虹彩病毒科待指定病毒属,位于该属ISKNV亚群和RSIV亚群之间,是该病毒属的一个新成员.

芋花叶病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

采用RT-PCR技术对采自中国湖北、浙江和山东的91份芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]样品的芋花叶病毒（Dasheen mosaicvirus,DsMV）进行了检测,检出率为26.4%。对其中14个DsMV分离物的317bp扩增产物（为外壳蛋白基因的一部分）序列分析的结果显示,各分离物内的核苷酸变异相对较低,而分离物间存在较大的分子变异,相似性为68.3%~97.8%。对来自湖北和浙江的2个DsMV分离物DsMV-SCS和DsMV-JH的外壳蛋白基因（coatproteingene,cp）进行了测序,全长分别为951bp和987bp,二者cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为79.0%和82.3%,与已报道DsMV的cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为73.0%~92.1%和74.8%~98.2%,在构建的系统发育树上聚在两个不同的簇,各DsMV分离物的系统进化关系与其寄主和地理来源无显著相关性。

甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因克隆及其实时荧光RT-PCR检测

甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV)引起的甘蔗黄叶病是一种新的全球性病毒病害。本文以YLSCPF1和YLSCPR591为引物,采用RT-PCR方法克隆了甘蔗黄叶病毒福建分离物(CHN-FJ1)外壳蛋白(CP)基因,编码196个氨基酸。分析不同地理来源的SCYLV病毒分离物cp基因核苷酸及其推导编码的氨基酸序列,同源性达95%以上。根据cp基因的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立了SCYLV的TaqMan实时荧光RT-PCR方法。结果表明,检测下限为初始质粒模板DNA 1 000拷贝/μL(约3.61 fg/μL),比常规PCR方法的灵敏度提高100倍。检测甘蔗花叶病毒、宿根矮化病菌和黑穗病菌,没有典型的扩增曲线和无Ct值。应用实时荧光RT-PCR、常规RT-PCR和组织印迹免疫杂交(TBIA)对田间甘蔗叶片样品进行检测,阳性检出率分别为100%、61.5%和69.2%,表明该方法比常规RT-PCR和TBIA具有更高的灵敏度,适合于对SCYLV的检测。

藏羊GM-CSF基因的RT-PCR扩增、序列分析及蛋白结构预测

为了研究藏羊GM-CSF基因及其编码蛋白的功能,提取藏羊脾脏总RNA,应用RT-PCR技术对藏羊GM-CSF基因进行扩增及测序,并利用DNA Star软件进行序列分析及编码蛋白结构预测。测试表明,藏羊GM-CSF基因长度为381 bp,编码127个氨基酸;藏羊GM-CSF基因与参考绵羊、藏羚羊、山羊和水牛的GM-CSF基因的核苷酸序列同源性依次为100%、99.2%、98.7%和92.1%,氨基酸序列同源性依次为100%、97.6%、96.9%和81.0%。蛋白结构预测表明GM-CSF蛋白具有1个N-糖基化位点、1个N-豆蔻酰化位点、1个粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号、2个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;综合二、三级结构预测得出,该蛋白主要由α螺旋组成,其次是β转角和无规则卷曲,而β折叠相对较少。研究成果可为青海藏羊GM-CSF基因抗病功能的研究提供参考。

新城疫病毒(长春株)F蛋白基因的克隆和序列分析

新城疫病毒（ＮＤＶ）长春株在鸡胚增殖后纯化，提取ＲＮＡ，然后利用特异性引物，经ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出了ＮＤＶ长春株的全长Ｆ基因。将该Ｆ基因插入ｐＫＳ（－）后，进行了序列测定。序列分析表明，该Ｆ基因核苷酸长度为１７５８ｂｐ，编码５５３个氨基酸，序列中有６个糖基化位点，１３个半胱氨酸残基，裂解位点区（１１２～１１７）氨基酸序列为Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ，与所有弱毒株在这一区域的序列（Ｇｌｙ－Ａｒｇ／Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ）相符，证明长春株为弱毒株。同源性分析表明，长春株Ｆ基因与目前国外发表的其他ＮＤＶＦ基因相比，核苷酸序列同源性在８８％～９９％之间。

大豆花叶病毒Sc株系外壳蛋白基因的部分序列分析

采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）扩增技术，体外扩增ＳＭＶ－Ｓｃ株系的外壳蛋白基因并进行部分测序．结果表明：所测５′端１５０个核苷酸序列同已发表的ＳＭＶ－ＢＪ（北京分离物）、Ｓａ株系同源率分别为９５％和９３％，３′端非编码区同ＢＪ株系同源率为８４％．

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以田间采集的马铃薯病叶中提取的马铃薯病毒S(PVS)总RNA为模板,通过RT-PCR获取长度为890 bp的PVS-cp的cDNA,克隆至pGEM-T载体上。酶切回收该基因片段,并构建了该基因的原核表达质粒pBV-pvs。SDS-PAGE凝胶电泳和Western印迹分析表明:PVS-cp基因在大肠杆菌JM109中可特异地高效表达分子量约33kD的蛋白,且表达蛋白具有良好的抗原活性。利用该表达产物免疫动物家兔,获得的抗血清可用于大田马铃薯S病毒的快速检测。

新城疫病毒(青岛株)F蛋白基因的克隆和序列分析

参考新城疫病毒 ( NDV)长春株的 F基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT-PCR对 NDV青岛株(野毒 )的 F基因进行了扩增 ,扩增产物克隆后测序。扩出的 F基因核苷酸长度为 792 bp,编码 2 6 1个氨基酸 ,包括完整的 F2片段和部分 F1片段。裂解位点区 ( 1 1 2～ 1 1 7aa)氨基酸序列为 Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe,与国外发表的强毒株序列相符 ,证明青岛株为强毒株。根据该基因推导的氨基酸序列 ,与国内外发表的 NDVF蛋白氨基酸序列相比 ,同源性为 88.1 %～ 94 .3%。

一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒（RHDV），命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性；但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成清晰的沉淀线；电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。采用RT-PCR方法将Yaan-1株的衣壳蛋白VP60基因进行了克隆测序，序列分析表明VP60基因序列全长1740bp，编码579个氨基酸，测序结果提交GenBank（注册号为DQ069280），并与世界各国的常规RHDV分离株进行比较，结果表明核苷酸同源性为90．0％～98．0％，氨基酸同源性为94．1％～99．0％，氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区；同时对Yaan-1株的分子量、等电点、疏水性、跨膜区等分子结构特征进行了分析。本研究首次报道了无血凝性RHDV中国分离株，丰富了地方毒株资源，为明确我国地方株的分子流行病学，以及对VP60蛋白分子特征研究提供了新材料。

云南烟草花叶病毒外壳蛋白基因的分离克隆及序列分析

从云南弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝植斑分离，经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ；在烤烟品种红花大金元上以ＴＭＶ普通株作对照进行致病率测定，确定为强毒株系。以烟草花叶病毒（ＴＭＶ）云南强毒株系ＲＮＡ为模板，根据国外研究结果，自行设计、合成寡核苷酸为引物，通过ＰＴ－ＰＣＲ体外扩增，得到约５００ｂｐ的ＤＮＡ片段，将其克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α上，并进行了序列分析。分析表明，该其因含４７７个核苷酸，编码１５９个氨基酸，与国外发表的Ｕ１株系比较，核苷酸同源率为９８．１％，氨基酸同源率为９７．５％。获得了云南烟草ＴＭＶ外壳蛋白全基因片段。

瓜实蝇热激蛋白基因hsp70的克隆及序列分析

【目的】克隆分析瓜实蝇热激蛋白hsp70基因序列特征,为进一步研究瓜实蝇的热适应性机制及制定综合防治策略奠定基础。【方法】根据NCBI数据库中已报道的昆虫hsp70基因保守序列,设计合成扩增瓜实蝇hsp70基因部分片段的简并引物,并利用RACE-PCR扩增其全长序列。【结果】克隆获得瓜实蝇hsp70基因c DNA全长序列(获取号:KM112021)2271 bp,含1911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸,具有真核生物hsp70基因家族的3个明显基序标签,同时在C-末端具有EEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白。BLAST分析结果表明该序列与双翅目实蝇科昆虫hsp70基因高度相似,最高相似度达91%。氨基酸序列系统发育分析结果显示,瓜实蝇与双翅目实蝇科昆虫聚类为一个分支,证实hsp70基因的高度保守。【结论】瓜实蝇hsp70基因具有真核生物hsp70基因家族的特征,序列表现为高度的保守性,可作为今后研究瓜实蝇抗逆性机制的一个参数指标。

鹅副粘病毒LS-1株的分离鉴定及F基因分析

从山东省梁山县疑似鹅副粘病毒感染的病死鹅中分离到1株LS-1病毒株,经血凝和血凝抑制试验,证实该毒株为禽1型副粘病毒.毒力测定结果表明,该病毒对鸡胚平均致死时间（MDT）为39.5 h;1日龄无特定病原体（SPF）鸡脑内接种分离病毒的致病指数（ICPI）为1.76;6周龄SPF鸡静脉接种致病指数（IVPI）为2.42.序列测定结果表明LS-1株F基因核苷酸长度为1 653 bp,编码为551个氨基酸,有6个糖基化位点,其裂解位点的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe-117,与已公布的强毒株裂解位点的氨基酸序列相符.同源性分析表明,该毒株F基因与目前已公布的鹅副粘病毒F基因核苷酸同源性在87.0%~98.4%之间,推导的氨基酸序列同源性在87.0%~98.5%之间.

兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆和生物信息学分析

应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL株中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,测序结果在GenBank中注册(登录号为DQ530363)。从GenBank下载全部已发表的40株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明,世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90%以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国4个不同大地区(西北、华东、东北、西南)的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对4个不同大地区的近年的4个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型的看法相一致。

茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3'-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1(GenBank登录号为HQ225758)。该基因开放阅读框为357bp,编码118个氨基酸,推测的蛋白质分子量为12.82KD,等电点约为9.57。多序列比对结果显示,该基因编码的氨基酸序列与其他植物的ARP蛋白序列相似性达到70%以上,具有生长素抑制基因家族的保守结构域。荧光定量PCR结果表明,CsARP1基因在休眠阶段表达量较高,而在解除休眠(萌发)后表达量较低,说明CsARP1基因可能与茶树芽休眠有关。

马铃薯块茎GBSS Ⅰ基因的cDNA克隆及其序列特征分析

以马铃薯普通栽培种"甘农薯2号"块茎为材料,利用RNA提取试剂盒提取总RNA,通过RT-PCR技术和DNA序列测定分析,证实获得了马铃薯颗粒结合淀粉合成酶(GBSS I)基因的cDNA序列。该cDNA全长1824bp,包括607个氨基酸和1个终止密码子序列,且与原序列(accession number X58453)同源性为99.78%,但与其他科植物GBSS基因的同源性较低,注册该基因到GenBank中,注册号为EU403426。利用生物信息学相关软件分析预测GBSS I基因cDNA序列编码的蛋白质功能和结构,结果发现,该蛋白与其他15种植物GBSS蛋白一样,具有3个完全保守区域,并具许多重要功能位点,且与农杆菌淀粉合成酶具有相似三级结构模型,表明该蛋白具淀粉合成功能。

新城疫病毒HB92株M基因的克隆和序列分析

采用RT PCR方法扩增了新城疫病毒 (NDV)无毒耐热株 (HB92株 )M基因 ,将其克隆于 pGEM T载体 ,并进行了序列测定和分析 .结果显示 ,测定的M基因长 12 2 3个核苷酸 ,包含一个 10 95个核苷酸的开放阅读框(ORF) ,编码 36 4个氨基酸 .与已报道的 10株NDVM基因比较 ,核苷酸同源性为 88.4 %～ 95 .8% ,氨基酸同源性为 89.8%～ 95 .3% ,HB92株与V4株M基因核苷酸的同源性最高 (达 95 .8% ) .NDVM蛋白分子中有 9对碱性氨基酸 ,在多肽的第 117～ 12 0位有一个含 4个氨基酸CKKS的特征性结构 .这些结果为揭示NDVHB92株的分子生物学背景 ,了解NDV的分子进化和遗传变异机理 ,进而开发利用HB92株奠定了基础 。

兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT-PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1.7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEMR-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1 740bp,共编码580个氨基酸。该核酸序列与其它国家报道的多株RHDV序列相互间同源性高达98.2%～99.0%,其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%～99.1%,为极度保守片段。

巴西橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因的克隆及序列分析

根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3'-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbLEA14基因的全长cDNA序列,其ORF长456 bp,编码151个氨基酸,预测HbLEA14蛋白分子量为16.58 ku,等电点为5.10。同源性比对显示,HbLEA14与蓖麻RcLEA14、乳浆大戟EeLEA14、陆地棉GhLEA14、大豆GmLEA14、拟南芥AtLEA14、番茄SlER5的同源性分别为88%、80%、75%、73%、65%和61%,属于非典型第2组LEA蛋白。RT-PCR结果显示,死皮植株胶乳中HbLEA14的表达量明显高于健康树。