人SND1基因慢病毒载体构建及稳定表达SND1蛋白的人卵巢癌SKOV3细胞株筛选

目的构建人SND1基因慢病毒载体,筛选稳定表达SND1蛋白的人卵巢癌SKOV3细胞株,为探讨SND1基因对卵巢癌的调控作用提供细胞系模型。方法采用PCR法从pCMV-FLAG-SND1质粒中扩增FLAG-SND1基因片段,连接到慢病毒载体表达质粒pLVX-IRES-Hyg中,获得重组慢病毒载体pLVX-FLAG-SND1。以pLVX-FLAGSND1瞬时转染293T细胞48 h,采用Western blotting法检测SND1蛋白表达量。pLVX-FLAG-SND1重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得携带FLAG-SND1的重组慢病毒。以慢病毒感染SKOV3细胞48 h,在细胞培养基中加入1μg/mL潮霉素B,筛选稳定表达SND1蛋白的细胞株,采用Western blotting法检测该细胞株内SND1蛋白表达量。结果重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确。重组慢病毒载体在瞬时转染的293T细胞中SND1蛋白表达量高于野生型SKOV3细胞(P<0.01)。SKOV3细胞经慢病毒感染、药物筛选后获得的稳定表达株中SND1蛋白表达量高于野生型SKOV3细胞(P<0.01)。结论成功构建了SND1基因慢病毒载体pLVXFLAG-SND1,并筛选出稳定表达SND1蛋白的SKOV3细胞株,为进一步明确卵巢癌发生、发展机制奠定了基础。

水牛SND1基因克隆及生物信息学分析

试验旨在利用电子克隆法对水牛SND1(staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1)基因进行克隆和序列分析,为探究该基因对水牛泌乳性能的作用机制奠定基础。以奶牛SND1基因(GenBank登录号:NM_205784.1)作为种子序列,利用Primer Premier 5.0设计3对引物,以水牛基因组DNA为模板,PCR扩增水牛SND1基因mRNA序列,扩增获得序列连接pMD18-T载体,通过测序拼接获得水牛SND1基因mRNA全序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,水牛SND1基因完整编码序列长为3 503bp,包含长为2 733bp CDS序列,编码910个氨基酸,蛋白分子式为C4523H7183N1281O1354S26,分子质量为102.01ku,理论等电点(pI)为6.74,不稳定系数为42.07,平均亲水性为-0.419,属可溶酸性蛋白。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,其中α-螺旋占37.80%,无规则卷曲占34.18%。结合Protfun 2.2在线软件对SND1的功能进行预测分析表明,该蛋白在嘌呤和嘧啶、中央中间代谢、能量代谢、氨基酸生物合成发挥功能的可能性分别为0.449、0.401、0.303和0.262。SND1基因编码区序列与黄牛、绵羊、山羊、猪、马、人的同源性分别为98.7%、97.8%、97.8%、93.8%、93.1%和91.7%,物种之间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。利用SMART在线软件预测蛋白结构域,结果显示,水牛SND1蛋白包含有4个SN区域,说明SND1基因编码区在进化过程中较为保守。