SNRNP200基因的研究进展

SNRP200为核前体mRNA的剪接基因,编码的蛋白质属于RNA解旋酶的DExH-box蛋白家族,其在全身组织中广泛表达。SNRNP200与前体mRNA的剪接密切相关,可以通过影响剪接来调控有关基因的表达,从而影响细胞的增殖。此外,SNRNP200在遗传性视网膜色素变性及急性髓系白血病发病中也起着重要作用。本文对SNRP200的结构特征、功能调控及对疾病的影响等方面作一系统综述。

miRNA-200b在糖尿病小鼠海马体中的异常表达及靶基因预测

目的分析糖尿病小鼠海马体miRNA-200b表达情况,并预测miRNA-200b靶基因。方法采用链脲佐菌素或联合高糖高脂饮食分别诱导1型和2型糖尿病小鼠模型,建模后处死小鼠,分离海马体组织,利用荧光定量PCR测定miRNA-200b表达量。通过miRWalk、miRDB和miRPathDB三个基因数据库预测miRNA-200b靶基因,进行GO分析和KEGG分析。结果成功建立糖尿病小鼠模型。糖尿病小鼠海马体中miRNA-200b表达量比正常小鼠下降(P<0.05)。生物信息学预测显示,miRNA-200b筛选到3个靶基因,分别是GAB1、SLC5A3和GICCL1,靶基因功能富集于糖代谢、脑部神经营养等信号通路。结论miRNA-200b在糖尿病小鼠海马体中显著下降,有望成为糖尿病治疗的新靶点。

IS200/IS605转座子家族编码的核酸酶OgeuIscB基因编辑体系的优化

目的提升来源于IS200/IS605转座子家族的RNA引导的核酸内切酶OgeuIscB的基因编辑效率。方法利用OgeuIscB蛋白已解析的晶体结构,计算氨基酸与核酸之间的原子距离,将距离小于10的非正电荷氨基酸残基突变为精氨酸(arginine,R)以提高OgeuIscB与核酸的亲和力,通过人胚肾293T细胞内源性位点验证不同突变体的基因编辑效率。结果经过两轮迭代突变,发现Q376R-S456R和A401R-S456R这2个双突变体在不同细胞系的多个内源性位点上均能显著提升OgeuIscB的基因编辑效率。结论基于结构对OgeuIscB蛋白进行理性蛋白质工程化改造,能够提升OgeuIscB核酸内切酶活性,为将其作为一种有效的基因编辑工具提供了实验依据。

利用基因芯片技术研究乌头碱抗KBV_(200)细胞耐药机制

目的采用基因芯片技术研究乌头碱抗KBV200细胞耐药机制。方法提取乌头碱12.5μg/mL用药组和对照组KBV200细胞的RNA,进行cDNA微阵列分析。结果整张基因芯片5504个基因克隆,其中用药前高表达基因208个,占克隆总数的3.8%,用药后高表达基因196个,占3.6%。用药前后细胞凋亡相关基因、CDKS家族、SMADS家族、MAPK信号转导系统等的基因发生变化。结论乌头碱可能通过影响细胞凋亡相关基因和影响MAPK信号转导系统等机制,最后作用于Mdr1基因的表达,从而起到抗耐药作用。

miR-200c调控RhoA基因表达介导RMP7增加血肿瘤屏障通透性机制的研究

目的研究miR-200c调控Ras基因家族成员A(RhoA)表达介导RMP7增加血肿瘤屏障(BTB)通透性的机制。方法应用real-time PCR检测RMP7作用BTB后人脑微血管内皮细(ECs)miR-200c的表达;应用miR-200c模拟物和miR-200c抑制物分别转染GECs(ECs和U87脑胶质瘤细胞共培养的细胞),测量跨内皮阻抗值(TEER)、辣根过氧化物酶(HRP)渗漏量,分析BTB通透性;应用Western blotting检测RhoA的表达;应用免疫荧光方法观察GECs中RhoA表达和分布;应用双荧光素酶报告基因检测miR-200c转录后水平调控RhoA机制。结果 RMP7作用GECs后,使GECs内源性miR-200c表达显著降低;miR-200c模拟物和miR-200c抑制物成功转染到GECs中;miR-200c模拟物显著抑制RMP7诱导TEER值的降低、HRP的升高;miR-200c模拟物显著减少RhoA的表达,促使RhoA在GECs细胞质和细胞核分布减少;miR-200c模拟物转录后水平负性调控RhoA基因表达。miR-200c抑制物与miR-200c模拟物实验结果相反。结论 miR-200c转录后水平负性调控RhoA表达,介导RMP7增加血肿瘤屏障通透性机制。

基因芯片技术筛选和鉴定CD133^+CD200^+大肠癌干细胞相关基因

目的筛选CD133+CD200+大肠癌细胞并鉴定其相关基因的表达。方法流式细胞术分选CD133+CD200+和CD133-CD200-大肠癌细胞,应用Affymetrix人类全基因组表达谱芯片检测这两群细胞的基因表达谱,初步筛选CD133+CD200+与CD133-CD200-大肠癌细胞之间的差异表达基因,进而寻找与大肠癌干细胞特异性相关的主效基因,最后利用qRT-PCR实验对部分差异表达基因进行验证,以确定芯片检测结果的可靠性。结果芯片结果显示差异在3倍以上的基因共655个,CD200+细胞表达上调的基因290个,表达下调的基因共365个,通过生物信息学分析和GENEMANIA共表达构建,筛选出3条(MDM2;PRKACG;CACNA1G)有特异相关的差异基因进行qRT-PCR验证,结果与芯片结果完全相符。结论基因芯片技术通过筛选和鉴定CD133+CD200+大肠癌干细胞相关基因,建立了特异性大肠癌干细胞基因表达谱,为大肠癌基因靶向治疗及进一步研究提供依据。

QX200微滴式数字PCR方法检测转基因大豆GTS-40-3-2

首次以转基因大豆中结构特异性基因为靶基因,建立了特异的微滴式数字QX200 PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,对其进行准确定量。结果表明:ddPCR对结构特异性基因的检出限为2拷贝/(20μL),检测灵敏度高于国标中qPCR方法。微滴式数字PCR方法是一种准确、高灵敏度的基因拷贝数的分析方法,操作简便,可在转基因检测领域广泛应用。

甲醇利用菌MB200丝氨酸乙醛酸氨基转移酶基因(sga)的克隆、突变及对产L-丝氨酸的影响

sga基因是大多数Methylobacteriumsp.中丝氨酸循环途径里的一个关键酶基因,与单碳化合物的同化及二碳化合物的代谢有着密切的关系。根据已报道的M.extorquensAM1的sga基因序列,合成寡核苷酸引物,用本实验室保存的甲醇利用菌M.sp.MB200的染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增出sga基因,测序分析表明该基因与M.extorquensAM1的sga基因在核苷酸水平上有93%的同源性,氨基酸水平上具有85%的同源性。利用自杀质粒pK18mob构建含有sga基因部分片段的重组质粒,通过三亲本结合后导入原始菌株MB200中,经过进一步同源单交换,sga基因被pK18mob插入突变,利用PCR和Southern杂交进行验证,选择发生正向突变的突变株MB200sTB用于进一步研究分析。分析结果表明突变菌株的丝氨酸乙醛酸氨基转移酶(SGAT)的酶活性消失,同时失去了在以甲醇为唯一碳源的培养基上生长的能力,不能再合成L-丝氨酸,但仍能以二碳化合物和多碳化合物进行生长。

外周血miR-200c水平对移植异基因造血干细胞后急性移植物抗宿主病发生的预测作用

目的探讨外周血miR-200c水平对移植异基因造血干细胞后急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生的预测作用。方法选择2014年1月至2018年10月在昆明医科大学第一附属医院血液科行异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)的51例患者作为研究对象,根据移植后是否发生aGVHD原则分为实验组(发生aGVHD)33例、对照组(未发生aGVHD)18例。抽取肘部外周血5 mL,RT-qPCR检测两组miR-200c,分析两组miR-200c表达差异。结果两组患者均移植成功,且恢复造血功能,恢复时间为18 d,其中33例发生aGVHD,18例未发生aGVHD,发生率为64.71%;实验组在移植前、移植后7、14、及72 d时,miR-200c表达均低于对照组(P<0.05);aGVHD发生后外周血中miR-200c显著低于发生前(P<0.001);与aGVHDⅠ度相比,aGVHDⅡ度患者外周血中miR-200c表达下调(P<0.05),与Ⅱ度相比,aGVHDⅢ度患者外周血中miR-200c表达下调(P<0.001);miR-200c高表达组患者2年总生存率高于低表达组(P<0.05);miR-200c对aGVHD疾病产生诊断价值较好。结论miR-200c水平降低与异基因造血干细胞移植后aGVHD的发生相关;随着aGVHD严重程度升高miR-200c表达水平降低,miR-200c低表达患者生存率较差。miR-200c可作为早期诊断和预测aGVHD的标志物。

装载mIFN-γ基因的溶瘤腺病毒CNHK200的抗肝癌活性

目的:研究鼠源γ-干扰素(mIFN-γ)基因插入溶瘤腺病毒CNHK200后,该病毒对不同的肝癌细胞系及其裸鼠移植瘤的增殖力及特异性杀伤作用。方法:用MTT法检测CNHK200-mIFN-γ在体外对人正常肝细胞L02、人肝癌细胞Hep3B、HepGⅡ的特异性杀伤作用;裸鼠体内试验观察CNHK200-mIFN-γ对肝癌Hep3B模型的抗肿瘤疗效。结果:CNHK200-mIFN-γ对正常人肝细胞L02无杀伤作用,但能特异性杀伤肝癌细胞,mIFN-γ的插入使病毒对肿瘤细胞的杀伤能力提高;动物体内,CNHK200-mIFN-γ具有明显的肿瘤生长抑制作用。结论:CNHK200-mIFN-γ可以高效率地杀死肝癌肿瘤细胞,而不杀伤正常细胞,可能具有良好的临床应用前景。

骨肉瘤中miR-200c表达水平与病理特征、 病情转归的相关性及潜在靶基因的分析

目的研究骨肉瘤中miR-200c表达水平与病理特征、病情转归的相关性并探究其潜在靶基因。方法回顾性选择2016年4月至2018年12月期间在华中科技大学同济医学院附属协和医院诊断为骨肉瘤的52例患者。观察骨肉瘤组织与瘤旁组织中miR-200c表达水平的变化;比较不同病理特征骨肉瘤中miR-200c表达水平;随访生存时间、绘制K-M曲线并进行Long-rank检验,分析不同miR-200c表达水平骨肉瘤患者的生存情况;分析骨肉瘤中AKT通路基因的表达及其与miR-200c的相关性。结果骨肉瘤组织中miR-200c的表达水平(0.47±0.09)明显低于瘤旁组织(1.06±0.20),差异有统计学意义(P<0.05)。EnnekingⅡb-Ⅲ期、有淋巴结转移的骨肉瘤组织中miR-200c的表达水平明显低于EnnekingⅠ-Ⅱa期、无淋巴结转移的骨肉瘤组织,差异有统计学意义(P<0.05)。骨肉瘤中miR-200c低表达患者的整体生存情况较miR-200c高表达患者恶化。骨肉瘤组织中蛋白激酶B(AKT)、哺乳动物雷帕霉素白蛋白(mTOR)的表达水平分别为1.88±0.31、1.73±0.30,明显高于瘤旁组织(1.04±0.18、1.02±0.19),差异均有统计学意义(P<0.05)。AKT、mTOR与miR-200c的表达水平呈负相关(r=-0.315,-0.228,P<0.05)。结论骨肉瘤中miR-200c呈低表达趋势并且能够促进肿瘤病理进程、影响远期生存,靶向AKT/mTOR是其可能机制。

人microRNA-200家族靶基因预测及生物信息学分析

目的对microRNA-200(miR-200)家族成员的靶基因进行预测和生物信息学分析,为进一步探讨miR-200家族的功能及其调节机制提供证据。方法运用靶基因预测软件TargetScan、PicTar2和miRanda分别预测miR-200家族9个成员的靶基因,再分别取各自在三个软件下预测所得靶基因的交集,然后利用miRTarbase数据库获取这9个miRNA经过至少3种实验验证并且靶向关系类型为具有功能的miRNA-靶基因互作的靶基因,将软件预测所得结果与靶向关系预测结果取并集,作为所纳入每个miRNA的靶基因集合,然后分别对靶基因集合进行生物学过程的功能富集,信号通路及蛋白质互作网络分析。结果 miR-200家族的预测靶基因富集于多个生物学过程,其生物学过程主要富集于:RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录负调控、DNA模板转录负调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录调控等;信号通路主要富集于:肿瘤、胶质瘤、黑色素瘤、肺小细胞癌等多种肿瘤和EB病毒感染、乙型肝炎等感染相关通路,蛋白质互作网络显示9个成员的预测靶基因编码蛋白质间存在复杂的相互作用,靶基因编码蛋白质"RAC1"、"SRC"、"RHOA"、"CREBBP"、"CTNNB1"在互作网络中具有核心地位。结论 miR-200家族中的成员通过调控靶基因进而调节下游靶蛋白参与肿瘤、感染等病理生理进程。

甲基营养菌Methylobacterium sp.MB200中与L-丝氨酸耐受性相关基因的克隆与分析

甲基营养菌MB200,能利用非C-C键低碳化合物生长并合成L-丝氨酸,对L-丝氨酸耐受浓度低,提高其在静息细胞反应系统中对L-丝氨酸的耐受能力可更好的提高L-丝氨酸的产量。利用质粒转座子pTnMod-RKm'构建了甲基营养菌MB200的突变体库,往培养基中添加20 mg/mLL-丝氨酸对突变体库中的突变体进行平板筛选,共筛选到177株耐受L-丝氨酸的突变体,以10mg/mL的浓度梯度复筛,发现某些突变体能最高耐受40 mg/mL L-丝氨酸。分别提取突变体总DNA,用BamHI酶随机酶切后连接到克隆载体pMD18-T上,导入到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,利用双抗性在(转座子抗性与T载体上的抗性)平板上挑取转化子,并提取质粒,酶切验证后进一步测序。共克隆到了17个基因,为提高甲基营养菌对L-丝氨酸的耐受能力提供了可研究的基因资源。

miR-200c通过下调TUBB3基因表达逆转老年肺癌患者顺铂耐药性的机制

目的探讨miR-200c逆转肺癌细胞顺铂耐药性的作用机制。方法miR-200c模拟物转染肺癌A549细胞后,采用实时定量PCR法检测miR-200c的表达;采用细胞活力测定(MTS)法检测miR-200c对肺癌A549细胞顺铂耐受性的影响。采用流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞凋亡率的变化。采用Western blotting检测肿瘤细胞耐药蛋白survivin和Bcl-2蛋白的表达。通过生物信息学分析发现miR-200c下游靶分子TUBB3表达存在差异后,构建TUBB33′UTR的野生型和突变型荧光素酶报告载体,然后利用双荧光素酶活性分析miR-200c对TUBB3基因表达的结合位点和调控作用。通过Western blotting检测miR-200c对TUBB3蛋白表达的调控作用以及Bcl-2蛋白和肿瘤细胞耐药蛋白survivin的表达。采用SPSS 19.0统计软件分析实验数据。结果与对照组相比,miR-200c转染肺癌细胞株后,肺癌细胞对顺铂的敏感性呈明显增加趋势[IC50分别为(37.3±3.1)和(15.3±3.3)μmol/L,P<0.01]。过表达miR-200c的A549/DDP组的细胞凋亡率明显高于NC组(P<0.01)。而肿瘤耐药相关基因Bcl-2和survivin蛋白表达降低。转染miR-200c mimics的A549/DDP细胞中TUBB3蛋白和mRNA的表达均下调(P<0.01)。双荧光素酶活性分析显示miR-200c对TUBB3基因表达具有调控作用(P<0.01)。这些结果均证实TUBB3为miR-200c的下游靶基因。pcDNA-TUBB3质粒转染后,过表达miR-200c的A549/DDP细胞株survivin和Bcl-2蛋白表达较miR-200c mimics组上调。结论miR-200c可通过下调TUBB3基因的表达逆转肺癌顺铂耐药细胞的耐药性。

延边半细毛羊羊毛细度测定及其CD200基因克隆与表达分析

本研究旨在了解CD200基因与延边半细毛羊毛用性状的相关性,为延边半细毛羊群体育种奠定理论基础。实验选择相同条件下饲养的体重相近的10月龄雌性延边半细毛羊20只,首先测定延边半细毛羊的细度,然后根据NCBI中绵羊CD200基因(登录号:XM012190412)的CDS区序列设计引物,通过RT-PCR扩增并克隆CD200基因,采用生物信息学软件进行序列分析;通过免疫组化方法说明CD200在皮肤毛囊中的定位表达。结果显示:延边半细毛羊的羊毛纤维直径为(19.26±2.69)μm;实验成功克隆出CD200基因,长度为729 bp,编码242个氨基酸残基,预测到蛋白二级结构由α螺旋、延伸链、无规则卷曲构成,蛋白质三级结构为球形;免疫组化结果显示CD200在毛囊的外根鞘、毛囊干细胞及表皮层表达。本研究结果表明延边半细毛羊的羊毛细度较细,可用于细毛羊的育种;CD200可能参与调控羊毛细度的表达。

hsa-miR-200c-3p的靶基因预测及生物信息学分析

目的:采用生物信息学方法对hsa-miR-200c-3p进行靶基因预测及功能分析,为进一步研究其在肿瘤中的作用和发生机制提供思路。方法:分析miR-200c-3p在不同物种间的保守性及hsa-miR-200c-3p在不同器官和疾病中的表达情况;miRDB和Target Scan预测hsa-miR-200c-3p靶基因,取其交集,合并已经实验证实的靶基因。采用DAVID 6.8数据库对基因集合进行GO功能和KEGG通路富集分析。结果:miR-200c-3p序列在物种间高度保守。hsa-miR-200c-3p在膀胱、胃肠道、脑、四肢、肺、前列腺等组织中表达丰度较高;与正常组织相比,在膀胱癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等疾病中表达水平较高。包括已被实验证实的靶基因,共得到79个候选基因,主要参与调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、基因表达、细胞增殖、信号转导等生物学过程,涉及前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌等疾病相关通路,以及PI3K-Akt、Ras等肿瘤相关信号通路。结论:hsa-miR-200c-3p功能广泛,参与人类生命活动和疾病过程,与癌症的发生、发展密切相关。

microRNA-200a在肝病发生发展中的作用

microRNA(miRNA)是一类小分子非编码RNA,能通过调控基因表达参与细胞的增殖和凋亡等多个环节。越来越多的证据表明miRNA-200a参与非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、药物性肝损伤、肝纤维化以及肝细胞癌的发生发展,本文总结了关于miRNA-200a通过靶向其不同的下游靶基因,调控相关信号通路进而在多种肝病的进展中发挥的不同的作用,为探索多种肝病的机制研究提供参考。

E200K突变的遗传型克雅氏病临床与影像学特点分析

目的探讨E200K突变的遗传型克雅氏病(genetic Creutzfeldt-Jakob disease,gCJD)的临床特征、影像学特点及EEG变化。方法回顾性分析首都医科大学宣武医院收治的1例E200K突变的gCJD患者的临床资料、影像学和遗传学资料及发病5个月后的随访结果。结果本例患者临床表现为精神行为异常、快速进展性痴呆、癫痫发作及行走不稳。影像学表现为皮层与基底节异常信号,EEG可见三相波周期性发放。基因检测提示朊蛋白(prion protein,PRNP)基因E200K突变。随访发现临床表现进行性加重,影像学表现为进行性脑萎缩与脑白质病变,发病18个月后死亡。结论E200K突变的gCJD具有朊蛋白病的一般特点,因基因型不同而表现一定的异质性。

牦牛VEGFA双荧光素酶载体构建及与miR-200b的靶向验证

为探究微小RNA(miR-200b)与血管内皮生长因子A(VEGFA)基因之间的靶向关系,采用miRanda和Targetscan软件预测牦牛miR-200b与VEGFA可能存在结合位点,构建了VEGFA基因3′UTR区的野生型和突变型双荧光素酶载体。利用与目的miRNA靶种子序列相结合基因的突变序列,构建该靶基因的突变型重组质粒(pGL3-promoter-mut VEGFA),再进行重组质粒和目的miRNA的miRNA mimic的共转染实验。结果表明,预测到的miR-200b与VEGFA基因的3′UTR区存在结合位点。PCR进行扩增和测序之后,VEGFA基因3′UTR区的野生型、突变型载体构建成功。共转染VEGFA野生型载体和miR-200b mimic的双荧光素酶活性极显著低于对照组(P<0.05),VEGFA突变型载体和miR-200b mimic共转染的双荧光素酶活性与对照组无显著差异(P>0.05)。说明VEGFA基因的3′UTR区能与miR-200b结合并抑制双荧光素酶活性,验证了VEGFA是miR-200b的靶基因。