电针干预对肌萎缩侧索硬化SOD1 G93A转基因小鼠脊髓SOD1、GSH-Px含量和Bax、Bcl2表达的影响

目的探讨电针干预对肌萎缩侧索硬化SOD1^(G93A)转基因小鼠(SOD1^(G93A) transgenic mice,SOD1^(G93A))脊髓铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-superoxide dismutase,SOD1)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的含量和B淋巴细胞瘤基因-2相关X蛋白(BCL2-Associated X,Bax)与B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl2)表达的影响;探讨电针干预调节SOD1^(G93A)转基因小鼠体质量及运动功能的效应及抗氧化应激、抗细胞凋亡、保护神经元的相关性。方法将SOD1^(G93A)转基因小鼠按照数字随机表法分为电针组、模型组,每组12只,另取同窝阴性小鼠12只作为空白组。电针组在针刺足三里穴、曲池穴的基础上加用电针。模型组和空白组予相同抓取固定。三组每周干预5天,连续干预4周。于干预前1天以及干预1周、2周、3周、4周后测量体质量及转棒实验潜伏期,并于干预4周结束后取脊髓组织,分别检测组织中SOD1、GSH-Px的含量和Bax、Bcl2的表达。结果(1)电针组体质量较模型组大,但仍然小于空白组(P<0.05)。(2)电针组较模型组转棒实验潜伏期长(P<0.05),但仍然较空白组短(P<0.05)。(3)与模型组相比,电针组SOD1、GSH-Px表达升高(P<0.05),但仍低于空白组(P<0.05)。(4)电针组Bax较模型组表达降低(P<0.05),Bcl2较模型组表达升高(P<0.05)。结论电针干预可以改善SOD1^(G93A)转基因小鼠体质量以及运动功能,可能通过抗氧化应激反应、抗凋亡、保护神经元多途径调节小鼠运动功能。

RhoA和ROCK2在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中的表达

目的:通过研究RhoA和ROCK2在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓内的表达变化以阐明Rho/ROCK信号通路在肌萎缩侧索硬化症(ALS)病程中的作用。方法:饲养SOD1-G93A转基因小鼠和同窝野生型小鼠至发病早期、中期和晚期,部分小鼠冰上剥离新鲜脊髓组织,利用RT-PCR方法检测RhoA和ROCK2 mRNA的表达,利用Western Blot方法检测RhoA和ROCK2蛋白的表达;部分小鼠行心脏灌注并剥离其脊髓组织制成冰冻切片,利用免疫组织化学染色方法检测RhoA和ROCK2蛋白的表达。结果:在SOD1-G93A鼠发病的早期、中期和晚期,转基因小鼠脊髓中RhoA和ROCK2的mRNA及蛋白表达均上调。免疫组织化学染色实验结果显示,野生型小鼠脊髓中RhoA和ROCK2弥散分布于胞质和突起中,阳性染色浅,SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中RhoA和ROCK2阳性染色深,大量聚集在细胞膜及细胞质。结论:RhoA和ROCK2在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中异常高水平表达与ALS脊髓区病变密切相关,可能参与ALS疾病进程。

丁苯酞对SOD1^(G93A)转基因鼠脊髓Ferritin表达的影响

目的探讨丁苯酞对SOD1G 93A转基因鼠的神经保护作用及其可能的机制。方法选取SOD1G 93A阳性小鼠48只,随机分为丁苯酞组(发病早期及终末期)和安慰剂组(发病早期及终末期),每组12只,观察SOD1G 93A转基因鼠的发病时间和生存期,采用免疫组化和蛋白印迹的方法观察SOD1G 93A转基因鼠腰髓铁蛋白(Ferritin)表达。结果丁苯酞组的发病时间为118.0±2.5d,与安慰剂组的109.5±2.2d相比较,P<0.05;生存时间为138.6±2.3d,与安慰剂组的128.1±2.8d相比较,P<0.05;免疫组化显示:发病初期,安慰剂组Ferritin阳性细胞显示胞浆和胞膜周围均匀着色,丁苯酞组Ferritin仅胞膜周围着色,胞核和胞浆着色不明显;终末期,丁苯酞组与安慰剂组相比,二者的Ferritin在胞核和胞浆均有着色;蛋白印迹显示:发病初期,Ferritin在腰髓表达量的相对值,丁苯酞组为0.81±0.23,与安慰剂组的1.57±0.43相比较,P<0.05;终末期,丁苯酞组为1.45±0.45,与安慰剂组的1.73±0.36相比较,P>0.05。结论丁苯酞延迟ALS小鼠的发病时间并延长其生存期,丁苯酞延迟小鼠发病可能与调节铁代谢有关。

RAC1、RAC3和IQGAP1在SOD1^(G93A)突变小鼠脊髓中的表达

目的:检测Ras相关C3肉毒菌毒物底物1(RAC1)、Ras相关C3肉毒菌毒物底物3(RAC3)和IQ结构域GTP酶活化蛋白1(IQGAP1)在SOD1^(G93A)突变小鼠脊髓中的表达变化。方法:选取SOD1^(G93A)突变小鼠与野生型(WT)小鼠作为动物模型,将其分为症状前期(出生70 d)、症状早期(出生95 d)、症状中期(出生108 d)和症状晚期(出生122 d)4个组别,利用RT-PCR检测小鼠脊髓中RAC1、RAC3和IQGAP1 mRNA表达,利用Western Blot和免疫荧光染色检测RAC1、RAC3和IQGAP1蛋白表达与定位。结果:与同窝WT小鼠相比,RAC1 mRNA表达水平在出生不同时间点SOD1^(G93A)突变小鼠脊髓中无明显变化;在出生95、108和122 d RAC3 mRNA均明显降低,IQGAP1 mRNA均明显升高;RAC1、RAC3和IQGAP1蛋白在出生95、108和122 d表达均明显降低;RAC1、RAC3、IQGAP1免疫阳性细胞主要分布在脊髓前角,即运动神经元所在的部位,RAC1、RAC3和IQGAP1均与神经元特异性核抗原(NeuN)标记的神经元共表达。结论:SOD1^(G93A)突变小鼠脊髓中RAC1、RAC3和IQGAP1的表达异常与肌萎缩侧索硬化症(ALS)的发病密切相关。

夹脊电针对ALS-SOD1^(G93A)转基因小鼠病程进展和行为学的影响

目的:通过夹脊电针干预ALS-SOD1^(G93A)转基因小鼠,观察其对小鼠病程进展和行为学的影响。方法:本实验以ALS-SOD1^(G93A)转基因小鼠为实验对象,应用美国Jackson实验室提供的引物和方案对ALS-SOD1G^(G93A)转基因小鼠进行PCR鉴定。根据病情进展观察小鼠的表型特征。30只ALS-SOD1^(G93A)转基因小鼠,随机分为电针组、手针组和模型组,每组10只(雌性7只,雄性3只),分别给予电针、手针、抓握及捆绑处理,联合应用悬尾试验、称重、转棒实验来观察小鼠的发病时间和生存期。结果:与模型组相比,电针组发病推迟了8天,有显著性差异(P=0.023),手针组发病推迟了5天,但无显著性差异(P>0.05)。与模型组相比,手针组、电针组小鼠生存期分别延长了5天和10天,有显著性差异(分别为P=0.039和P=0.000),与手针组比较,电针组生存期延长了5天,有显著性差异(P=0.042)。与模型组相比,电针治疗能够明显延缓小鼠体重丢失,有显著差异(P<0.05),手针组小鼠体重丢失亦得到一定的延缓,但没有看到显著作用(P>0.05)。与模型组相比,手针组和电针组转棒运动功能明显得到改善,分别延长了1周和2周。结论:夹脊电针能够延迟ALS-SOD1^(G93A)转基因小鼠的发病,延长小鼠的生存期,改善小鼠的运动功能障碍。

丁苯酞对肌萎缩侧索硬化模型小鼠的生存期脊髓前角运动神经元Nrf2及HO-1表达

目的探讨丁苯酞(NBP)对SOD1^(G93A)转基因小鼠的生存期及脊髓前角运动神经元Nrf2、HO-1表达的影响及机制。方法肌萎缩侧索硬化(ALS)模型SOD1^(G93A)转基因小鼠24只,随机分为NBP组(n=12雌雄各半)和安慰剂组(n=12雌雄各半)选同窝SOD1^(G93A)阴性小鼠作为阴性对照(n=12雌雄各半)。于6w龄起分别给予NBP组NBP 180mg·kg^(-1)·d^(-1),安慰剂组玉米油10mL·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,至终末期取材。观察两组的发病时间及生存期。通过甲苯胺蓝染色比较终末期两组小鼠脊髓前角运动神经元数目,通过免疫组织化学染色、蛋白印迹法观察干预前后脊髓前角Nrf2、HO-1的分布、表达情况。结果相比安慰剂组,NBP组可推迟转基因小鼠的发病时间(P<0.05)显著延长小鼠生存期(P<0.01);终末期残存的脊髓前角运动神经元数量明显增加(P<0.01)。免疫组织化学染色结果显示,与安慰剂组相比,NBP组Nrf2在胞质内具有较强的免疫反应性差异有统计学意义(P=0.004)。NBP组HO-1在胞质内具有较强的免疫反应性差异无统计学意义(P=0.275)。蛋白印迹结果显示,相比安慰剂组,NBP组Nrf、HO-1蛋白的表达均明显增加(P均<0.05)。结论NBP可以推迟SOD1^(G93A)转基因小鼠的发病时间并显著延长生存期,增加细胞质内Nrf2、HO-1的表达。

家族性肌萎缩侧索硬化动物模型脊髓侧角神经元特征

目的探讨脊髓侧角神经元在SOD1G93A转基因鼠发病过程中的变化特征。方法利用甲苯胺蓝染色及免疫组化的方法观察SOD1G93A转基因小鼠不同病变时期上、中、下胸髓侧角神经元的数量变化特征。结果甲苯胺蓝染色法定量研究发现不同时期SOD1G93A转基因小鼠上胸髓、下胸髓水平,症状前期和发病期神经元计数较终末期均有显著性差别(P<0.05);与对照组相比,终末期胸髓各段侧角神经元计数明显减少且有统计学意义;免疫组化发现SOD1G93A转基因小鼠上胸髓、中胸髓水平不同时期相比,症状前期和发病期乙酰胆碱酯酶(AchE)阳性神经元计数较终末期均有显著性差别(P<0.05);与对照组相比,发病期上胸髓及终末期中、下胸髓水平侧角AchE阳性神经元数量减少具有统计学意义;结论在SOD1G93A转基因鼠发病过程中,存在脊髓侧角神经元丢失,尤其是在疾病的终末期,上、中、下胸髓节段间无明显差异。

利美尼定促进突变SOD1蛋白质降解的作用研究

目的利美尼定对家族性肌萎缩侧索硬化症(ALS)相关突变蛋白质SOD1G93A的作用机制.方法用瞬时转染的方法在运动神经元样细胞系NSC-34中过表达WTSOD1,与家族型ALS相关的SOD1G93A突变蛋白,再给予自噬通路的特异性诱导剂和阻断剂,通过Western blot蛋白印迹法检测突变SOD1、自噬标记物的蛋白质表达水平.结果自噬诱导剂trehalose可以使SOD1G93A蛋白质表达水平明显减少.在自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)的干预下,SOD1G93A蛋白质表达水平明显升高.l0uM利美尼定能够明显降低G93A SOD1的表达,但对WT SOD1的表达水平无明显影响.结论SOD1G93A主要经由自噬途径降解,利美尼定能够明显促进G93A SOD1的降解,但对WT SOD1的蛋白质表达水平无明显促进作用.

加味四君子方对肌萎缩侧索硬化转基因小鼠模型的神经保护作用

目的探讨加味四君子方对肌萎缩侧索硬化SOD1^(G93A)转基因小鼠的神经保护作用。方法将24只SOD1^(G93A)转基因肌萎缩侧索硬化模型小鼠随机分为3组,即肌萎缩侧索硬化模型组、加味四君子方治疗组、利鲁唑治疗组,每组8只,分别给予相应的干预措施。观察各组发病时间、死亡时间、转棒时间,通过HE染色观察各组小鼠的脊髓、神经、腓肠肌肌肉的组织形态,采用免疫组化和免疫印迹法对异常磷酸化神经丝及其蛋白水平进行观察。结果 (1)与安慰剂(生理盐水组)相比,加味四君子组及利鲁唑组分别推迟了发病时间7天和8天,延长生存期10天和10.3天(P<0.001);加味四君子方组与利鲁唑组发病时间和生存时间比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)12~17周,加味四君子方组及利鲁唑组明显延长了小鼠的转棒时间,与生理盐水组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而加味四君子方组与利鲁唑组小鼠各时期运动时间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)HE染色结果显示,生理盐水组的脊髓组织切片可见神经细胞减少、肿胀,胶质细胞增生;加味四君子方组和利鲁唑组见神经细胞变形、排列紊乱,胶质增生不明显。前根神经组织切片经HE染色后,生理盐水组可见神经纤维断裂,神经细胞变形,神经轴索变细;加味四君子方组见部分神经纤维断裂,部分神经细胞水肿;利鲁唑组可见神经细胞排列紊乱,部分神经纤维断裂。腓肠肌肌肉经HE染色后,生理盐水组可见肌节排列紊乱、肌纤维坏变、核聚集和核变形;加味四君子方组可见肌细胞排列紊乱,肌横纹模糊,部分肌纤维萎缩,细胞变形;利鲁唑组可见细胞聚团现象,肌横纹模糊,部分肌细胞变形。(4)免疫组化显示,加味四君子方组和利鲁唑组的脊髓前角、前根神经SMI-32阳性神经元数量较阴性对照组少,但较生理盐水组多,差异具有统计学意义(P<0.05);SMI-31阳性神经元数量较阴性对照组多,但较生理盐水组少,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)SMI-31免疫印迹的结果显示,生理盐水组SMI-31的表达水平明显高于阴性对照组,加味四君子方组和利鲁唑组的表达水平低于生理盐水组,明显高于阴性对照组,其结果与免疫组化结果一致。结论加味四君子方和利鲁唑均具有延迟SOD1^(G93A)转基因肌萎缩侧索硬化模型小鼠发病时间的作用,且两组延长生存期和改善运动功能的作用相当;中药加味四君子方可能通过抑制神经丝的异常磷酸化,减少异常磷酸化的神经丝在核周异常聚集,从而维持细胞骨架的完整性,减轻轴索萎缩,改善轴浆运输,延缓神经元变性,发挥其神经保护作用。

肌萎缩侧索硬化小鼠内源性神经干细胞膜突触蛋白表达

背景:成纤维细胞生长因子2是神经系统主要的神经营养因子之一,目前已经被证明有促进内源性神经干细胞分化的作用。目的:观察成纤维细胞生长因子2干预下,肌萎缩侧索硬化SOD1G93AG1H转基因小鼠运动功能的改变,内源性神经干细胞的增殖情况,突触蛋白的水平改变及内源性神经干细胞增殖数目与突触蛋白水平改变的相关性。方法:取新出生SOD1G93AG1H转基因小鼠(肌萎缩侧索硬化模型小鼠)60只分为肌萎缩侧索硬化组及成纤维细胞生长因子2组各30只,取新出生野生B6SJL小鼠30只作为正常对照组,成纤维细胞生长因子2组腹腔注入成纤维细胞生长因子2;肌萎缩侧索硬化组和正常对照组腹腔注入安慰剂生理盐水。分别于出生后60,90,120d采用Rotarod方法评估小鼠运动功能的改变,采用免疫组织化学方法标记内源性神经干细胞和突触蛋白并计数,用spearman方法评估内源性神经干细胞增殖数目与突触蛋白水平的相关性。结果与结论:与肌萎缩侧索硬化组相比,成纤维细胞生长因子2组小鼠运动功能明显改善,内源性神经干细胞增殖和突触蛋白水平显著增高。小鼠内源性神经干细胞的增加与突触蛋白水平的增呈正相关。提示成纤维细胞生长因子2神经保护机制可能与其促进内源性神经干细胞增殖和提升突触蛋白水平相关。