Oligofectamine介导转录因子SP1诱骗性寡核苷酸转染猪内皮细胞系条件的优化研究

目的确定SP1诱骗性寡核苷酸(Decoy Oligodeoxynucleotides,ODNs)在Oligofectamine介导下转染猪血管内皮细胞系SV-40-PED的最佳转染条件和效果。方法以SV-40-PED为转染对象,在6孔培养板中,接种SV-40-PED细胞2×105/孔,将4μlOligofectamine和不同浓度的SP1ODNs(2.5、5.0、7.5、10.0和12.5μl)分别溶于100μl无血清、无抗生素的DMEM培养基,室温放置20min后转染细胞,SP1ODNs最终浓度分别为50、100、150、200和250nmol/L、转染26h检测不同浓度转染情况,确定最佳SP1ODNs与Oligofectamine的比率、转染时间;流式细胞仪检测细胞内的相对荧光强度及摄取率评价转染效率;荧光显微镜观察细胞内荧光分布;测定细胞上清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量,观察细胞损伤情况。结果SV-40-PED在Oligofectamine的介导下可以摄取SP1ODNs。SP1ODNs终浓度为50、100、150nmol/L组细胞形态无明显变化,终浓度为200、250nmol/L组细胞收缩、变圆后逐渐恢复;SP1ODNs终浓度为250nmol/L时,转染26h时细胞形态也无明显变化,48、72h时有细胞漂浮现象。荧光下观察,转染成功各组荧光物质分布于细胞核内,其中SP1ODNs终浓度为200、250nmol/L组可见清晰核仁,浓度越高,荧光强度越强,细胞内荧光物质主要聚集于细胞核。SP1ODNs终浓度为250nmol/L时,转染72h组LDH浓度为137.12±3.92U/L,显著高于26h的49.61±17.13U/L和48h的120.26±8.42U/L,均有统计学意义(P<0.01);当转染时间为26h时,各浓度组上清液LDH值差异无统计学意义(P>0.05)。结论SP1ODNs终浓度为250nmol/L、转染26h时可以为SV-40-PED转染提供良好效果。

转录因子SP1诱骗性寡核苷酸对猪血管内皮细胞α半乳糖苷链表达的影响

目的:探讨转录因子SP1诱骗性寡核苷酸(decoy ODN)对猪血管内皮细胞系(SV-40-PED)膜蛋白α半乳糖苷链(αGal)表达的影响。方法:SP1诱骗性寡核苷酸转染猪血管内皮细胞系,细胞爬片后荧光显微镜下观察αGal抗原表位的表达;蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白表达情况;RT-PCR法检测SV-40-PED转染前后α1,3半乳糖转移酶(α1,3GT)mRNA。结果:荧光显微镜下细胞爬片可见转染组(decoy ODN组)细胞膜荧光表达明显减弱,部分部位可见点状荧光缺损。Western blot显示decoy ODN/PED的αGal相对吸光度值为48.2±0.9,仅为空转染组(只含有转染试剂oligofectamine)91.6±1.7的52.6%(P<0.05)。转染组α1,3GT基因异构体的mRNA表达量(异构体1为0.42±0.20;异构体2为0.27±0.12)显著低于空转染组(异构体1为0.72±0.17;异构体2为0.50±0.19;P<0.05),但错配组(错义decoy ODN组)及空转染组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:SP1 decoy ODN可以靶向性抑制猪血管内皮细胞系αGal基因的表达。

激活剂蛋白-1诱骗性寡核苷酸对大鼠颈总动脉损伤后新生内膜的影响

目的探讨激活剂蛋白1(AP1)诱骗性寡核苷酸对大鼠颈总动脉损伤后新生内膜的影响及其作用机制。方法36只Wistar大鼠随机分为3组,每组12只,均建立颈总动脉损伤模型,单纯损伤组不予任何处理;Lipofectin转染试剂组局部释放Lipofectin;治疗组局部释放AP1诱骗性寡核苷酸,3组均于于术后30min、3h、7d处死13取材,观察比较内膜增生程度,免疫组化方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)和c fos。结果单纯损伤组和Lipofectin转染试剂组7d时可见内膜明显增生,且有较多平滑肌细胞表达PCNA,c fos30min表达达高峰。而治疗组内膜增生程度减轻,PCNA、c fos的表达率明显下降,差异有显著意义(P<0.05或P<0.01)。结论局部转染AP1诱骗性寡核苷酸可明显抑制动脉损伤后的内膜增生,下调PCNA、c fos的表达。

核因子kappaB的诱骗性寡核苷酸对肿瘤坏死因子-α诱导的细胞间粘附分子-1表达的影响

目的 探讨人脐静脉内皮细胞中 ,核因子kappaB (NF κB)的诱骗性寡核苷酸对肿瘤坏死因子(TNF) α诱导的细胞间粘附分子 (ICAM) 1表达的影响。方法 采用培养的人脐静脉内皮细胞株ECV30 4 ,脂质体介导法转染寡核苷酸 ,以流式细胞仪检测转染效率 ,电泳迁移率转换试验检测诱骗性寡核苷酸与NF κB转录因子的亲和力及特异性 ,并以RT PCR和流式细胞仪测定其对TNF α诱导的粘附分子ICAM 1表达的影响。结果 诱骗性寡核苷酸能与NF κB特异结合 ,并可显著下调TNF α诱导的人脐静脉内皮细胞ICAM 1的表达。结论NF κB的诱骗性寡核苷酸可显著下调NF κB调控的与动脉粥样硬化相关的粘附分子的表达 ,为核酸药物防治动脉粥样硬化的临床应用提供一些前期资料。

核因子-κB的反义及诱骗性寡核苷酸联合作用对内皮细胞间黏附分子-1表达的影响

目的探讨在人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)ECV304中,核因子(NF)-κB的反义及诱骗性寡核苷酸联合作用对肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导的细胞间黏附分子-1(ICAM一1)表达的影响。方法采用反义和诱骗性寡核苷酸分别和联合干预ECV304,流式细胞仪检测寡核苷酸转染效率,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪荧光活细胞测定和免疫组织化学染色法分别从mRNA和蛋白质水平检测TNF-α诱导的ICAM-1表达。结果脂质体介导的转染法能有效地将单链、双链寡核苷酸转染至ECV304中。联合转染反义及诱骗性寡核苷酸的ECV304细胞的ICAM-1 mRNA表达较TNF-α诱导者降低42.58%(P<0.05),ICAM-1在细胞表面的表达降低85.46%(P<0.05),且下调幅度均显著大于反义寡核苷酸或诱骗性寡核苷酸的单独作用(P值均<0.01)。免疫组织化学染色也获得同样结果。结论NF-κB的反义及诱骗性寡核苷酸可显著下调NF-κB调控的与动脉粥样硬化相关的黏附分子表达,且联合作用效果强于单独作用,这可能为核苷酸干预防治动脉粥样硬化提供新的思路。

转录因子诱骗性寡核苷酸转染猪血管内皮细胞抑制人补体介导的异种细胞毒作用

目的探讨转录因子SP，诱骗性寡核苷酸（decoyODNs）转染的猪血管内皮细胞对人血清补体介导的异种细胞毒作用的影响。方法将培养的永生化猪血管内皮细胞系细胞株SV40-PED分为3组。转染组：SV-40PED转染了SP，decoyODNs；错配组：S驴4D—PED转染了错配的decoyODNs；空转染组：SV-40PED仅用转染试剂oligofectamine作用。转染后26h，采用细胞爬片免疫荧光技术、蛋白印迹法、逆转录聚合酶链反应及乳酸脱氢酶释放试验进行检测，分别观察各组SV40-PED胞膜a半乳糖残基（regal）、蛋白质和α1，3-半乳糖基转移酶（α1，3-GT）mRNA等表达的变化，以及转染了SP，decoyODNs的SV-40PED对人血清补体介导的细胞毒作用的影响。结果转染组SV-40-PED胞膜α—G1的荧光表达明显减弱，部分胞膜可见点状荧光缺损，而空转染组和错配组仍可见明亮的绿色荧光。转染组蛋白表达水平均有不同程度的下降，相对吸光度（A值）仅为未转染组的52．6％。转染组α1，3GT基因异构体1和2mRNA的相对表达量分别为0．42±0．20和0．27±0．12，空转染组分别为0．72±0．17和0．50±0．19，两组比较，差异有统计学意义（P〈0.05）；错配组与空转染组相比，差异无统计学意义（P〉0.05）。体积分数为20％和40％的人血清对空转染组和错配组SV40-PED均有不同程度的杀伤，而对转染组SV-40-PED的杀伤明显减弱（P〈0.，05）。结论经SP，decoyODNs转染的猪血管内皮细胞可以抑制人血清补体介导的异种细胞毒作用。