牛源MRSA新疆流行株的分离鉴定及spa基因多态性分型

【目的】明确新疆地区牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)流行株的流行特点,为有效防控新疆奶牛乳房炎和子宫内膜炎提供参考依据。【方法】采用分离培养、生化鉴定、药敏试验等方法对牛源MRSA进行鉴定,并以PCR扩增牛源MRSA新疆流行株spa基因的X区,测序结果列提交至spa分型数据库(http://www.ridom.de/spaserver/)进行spa基因多态性分型。【结果】从221份样品中共检测出71株金黄色葡萄球菌,其中对苯唑西林抑菌直径小于10mm的有8株;而以mec A引物进行PCR扩增,发现扩增结果呈阳性的有13株,MRSA检出率为18.3%。spa基因分型有4种,分别为t779、t2883、t13751和t1939,其中5株为t779(r08),4株为t2883(r07-r23-r21-r17-r34),2株为t13751(r07-r23-r12-r21-r17-r12),2株为t1939(r07-r23-r02-r34),即t779(r08)为MRSA新疆流行株的主要spa基因分型。【结论】MRSA在新疆不同地区均有分布,且其耐药情况不断变化,以t779(r08)为MRSA新疆流行株的主要spa基因分型。

进出口食品中金黄色葡萄球菌spa基因的分型

目的对我国进出口食品中分离得到的金黄色葡萄球菌进行spa基因分型。方法对36株金黄色葡萄球菌的spa基因进行PCR扩增,并对产物进行测序分析,测序结果通过数据库进行spa基因分型。结果共分出16个基因型,分别为t189、t091、t164、t002、t899、t197、t1044、t034、t156、t7400、t2592、t4209、t127、t437和两株新发现的基因型。其中t189型共有13株,t091型共4株,t164和t002型分别为3株,其余型分别为1株。结论 食品中分离出的36株金黄色葡萄球菌spa分型以t189居多,t091型次之,其他14型相对较少。

金黄色葡萄球菌胶乳凝集试验及spa基因序列改变与万古霉素耐药关系探讨

目的研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)胶乳凝集试验及spa基因序列改变与万古霉素耐药的关系。方法检测体外诱导对万古霉素耐药金葡菌过程中的金葡菌胶乳凝集试验结果改变情况,并利用单链构象多态性(SSCP)技术及DNA测序分析金葡菌spa基因序列有无改变。结果3株对万古霉素产生中介耐药的金葡菌在诱导过程中胶乳凝集试验发生改变,其中2株金葡菌spa基因序列有改变。结论spa基因碱基序列的改变,可能与金葡菌对万古霉素耐药有一定关联。

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的:克隆大鼠肺表面活性蛋白A(SPA)基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性,为进一步研究SPA基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA基因序列,对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析,推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic中,构建pGL3-SPA质粒,将其亚克隆于pGL3-control中,构建pGL3-SPA-enhancer质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞,用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer质粒、pGL3-SPA质粒转染H441细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性,为下一步研究SPA基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌spa基因分型

目的研究浙江省瑞安地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的spa基因分型。方法采集2011年3-11月瑞安市人民医院检验科微生物室临床分离的金黄色葡萄球菌菌株,共100株。采用头孢西丁纸片法筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,PCR扩增MRSA spa基因的X区,测序后通过数据库进行分型。结果 48株确证为MRSA,可分为16个型别,其中t030型15株,t437型12株,t6944型5株,t172型3株,t9538型2株,t5699、t148型、t179型、t1751型、t015型、t5554型、t127型、t159型、t062型、t163型各1株,同时发现1个新型t10149。结论瑞安地区MRSA的spa分型以t030和t437为主,t10149为新型菌种。

马鞍山市金黄色葡萄球菌鉴定及SPA基因多态性分析

目的鉴定分离自马鞍山的金黄色葡萄球菌,探索使用金黄色葡萄球菌SPA基因对菌株进行多态性分析。方法采集马鞍山市食品、食物中毒和腹泻患者标本,按照GB/4789.10-2003和WS/T80-1996进行金黄色葡萄球菌的分离培养。对分离的菌株,用过氧化氢酶和血浆凝固酶试验后,用生化实验对菌株进行鉴定。提取鉴定为金黄色葡萄球菌的DNA作为模板,PCR扩增菌株的SPA蛋白X区域并测序,测序结果提交数据库(http://www.seq-net.org/)进行分型,采用分型软件Ridom Staph Type对分型结果进行聚类分析。结果 共分离和鉴定54株金黄色葡萄球菌,其中食品、食物中毒和腹泻标本分别为36株、11株和7株。所有菌株的过氧化氢酶及血浆凝固酶均为阳性,生化实验鉴定为金黄色葡萄球菌。54株菌株可分成19个型,分别为t 189型11株、t 701型9株、t 091型7株、t 1376型5株、t 011型、t 127型各2株、t 084型、t 163型、t 459型、t 547型、t 548型、t 791型、t 954型、t 1544型、t 4336型、t 5269型、t 5353型各1株,同时发现2个新型,分别为t 5269和t 5353型。两起食物中毒的型别分别为t 189型和t 701型。结论 SPA基因分型方法具有快速、易于标准化的特点,可用于食物中毒的流行病溯源。

福建省2013年食源性金黄色葡萄球菌spa基因分型特征

目的对福建省食源性金黄色葡萄球菌分离株进行spa基因分型,掌握该分型技术和了解型别特征,为预防食源性疾病的暴发提供溯源方法和基础数据。方法对2013年福建省食品安全风险监测中从不同种类食品所分离的30株金黄色葡萄球菌采用PCR方法扩增A蛋白基因(spa)的X区域,序列信息通过spa基因分型国际官网(http://www.ridom.de/spaserver/)数据库,在起始端和末端保守序列之间查找不同串联重复序列的排列方式确定型别。如果数据库中无可以比对的型别,则将双向测序的结果和测序峰图上传官网,通过负责官网数据的专家确认是否为新的型别,并给出新的型别号。结果 30株金黄色葡萄球菌分为19个spa基因型,分别是t091(6株)、t14534(2株)、t899(2株)、t701(2株)、t1376(2株)、t189(2株)、t306(2株)、t14752、t286、t002、t14475、t4445、t085、t377、t2883、t2310、t796、t127和t14867,标准株ATCC6538的型别为t3297。其中,t14534、t14752、t14867这3个型为新发现的spa基因型。结论福建省2013年所分离的30株食源性金黄色葡萄球菌的spa基因型主要以t091为主。

拟南芥角果角度相关基因SPA的分子鉴定与功能分析

利用T-DNA插入突变的方法从拟南芥中筛选得到1个角果果柄生长角度变小的突变体,克隆得到该突变基因为SPA基因,并利用PCR和RT-PCR方法验证了T-DNA的插入位点;将SPA基因转入spa突变体后,互补植株角果角度恢复到野生型水平.推测SPA基因可能在调控角果角度方面具有重要功能.

丹毒丝菌SpaA基因免疫保护区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】以毕赤酵母Pichia pastoris X-33为宿主表达猪丹毒丝菌Erysipelothrix rhusiopathiae Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.【方法】以采集于广东某猪场的猪丹毒丝菌为模板,根据NCBI中已发表的Spa基因c DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增得到Spa A-N,并将其连接到表达载体p PICZαC上,得到重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N;用Sac I酶将重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N线性化后电转化入毕赤酵母X-33,经含博来霉素ZencinTM抗性的YPDS平板筛选和PCR鉴定的阳性转化子,用含不同浓度博来霉素抗性的YPDS平板筛选出高拷贝子并进行甲醇诱导培养,分别于诱导48、72、96 h后离心收集上清液,立即做SDS-PAGE,并进行SDS-PAGE及Western-blot试验.【结果和结论】成功克隆并表达了Spa A-N基因,构建了重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N,并以毕赤酵母X-33为宿主成功表达了猪丹毒丝菌Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.丹毒丝菌Spa A-N作为免疫保护区在酵母宿主中得以成功表达.

日本发现与慢性骨髓性白血病发病相关的基因

京都大学生命科学研究科凑长博教授等人发现与细胞增殖相关的基因“SPA1”，并对其功能做了细致研究，利用基因技术使刚出生的实验鼠体内的“SPA1”基因不发挥作用，1年后实验鼠开始出现慢性骨髓性白血病症状，又过了半年左右，发展为急性骨髓性白血病。这和人通常在中年以后发生慢性骨髓性白血病、进而转为急性的过程相同。

异质性万古霉素中介的金黄色葡萄球菌的分子特征

目的了解我院异质性万古霉素中介的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分布及分子学特征。方法对2015年10月至2016年5月我院临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,采用菌群分析策略-曲线下面积法(PAP-AUC)筛选异质性万古霉素中介的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;采用多重PCR法对hVISA进行agr、spa、SCC基因分型测定,对PCR产物进行测序确定spa分型。结果分离的79株MRSA经筛选获得9株h VISA;9株hVISA中有7株为agr-Ⅰ型,2株为agr-Ⅲ型;有6种spa克隆型,包括t437(4株),t114(1株)、t2310(1株)、t14062(1株)、t030(1株)、t16472(1株)。SCCmec分型以Ⅳa型为主,占55.56%,其次为Ⅲ型33.33%、Ⅱ型11.11%。结论我院hVISA检出率为11.39%,呈多克隆流行。

环介导等温扩增法快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

建立一种应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistan Staphylococcus aureus,MRSA)中mecA和spa基因的检测方法。以金葡菌和其他相关菌种为试验对象,分别用聚合酶链式反应(ploymerase chain reaction,PCR)和LAMP方法检测mecA和spa基因。结果表明:LAMP法在64℃等温条件下可在60min内成功扩增基因,且与传统PCR方法结果相同;通过琼脂糖凝胶电泳可知,LAMP对mecA和spa基因的检测限分别为每菌管102个和10个细胞;肉眼可检测到的mecA和spa基因的检测限分别为每菌管103个和10个细胞;然后用LAMP法检测人工污染原料乳样本中MRSA,用LAMP法检测原料乳中的mecA和spa基因与PCR方法显示出相同的结果。LAMP方法可快速检测mecA和spa基因,此方法可应用于原料乳中MRSA的检测。

金黄色葡萄球菌的耐药性分析与基因分型研究

目的了解金黄色葡萄球菌临床分离株的耐药性及其分子流行病学特征,为临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的预防治疗提供参考。方法采用纸片扩散法检测2012年1-12月临床分离的42株金黄色葡萄球菌的耐药性,并对MRSA进行判定;应用多重PCR法对MRSA进行SCCmec分型,并用PCR方法扩增其spa基因,测序后通过数据库进行spa分型。结果 42株金黄色葡萄球菌中共检出28株MRSA,检出率为66.7%;金黄色葡萄球菌对呋喃妥因、喹奴普汀/达福普汀和万古霉素均100.0%敏感,MRSA对头孢类、氟喹诺酮类和大环内酯类抗菌药物的耐药率明显高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA),差异有统计学意义(P<0.05);MRSA的SCCmec基因型以SCCmecⅡ型为主,占89.3%,SCCmecⅢ型占10.7%,28株MRSA共检测到6个spa型别,包括spa-t311型15株、spa-t002型8株、spa-t030型2株,spa-t034、spa-t127、spa-t14165型各1株,其中spa-t14165为该研究发现的新spa型。结论 MRSA占金黄色葡萄球菌比例较高,主要流行株为SCCmecⅡ型菌株,spa分型以spa-t311克隆型和spa-t002克隆型为主,spa-t14165为新型临床多耐药菌株。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分型及流行现状

【目的】研究杭州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的基因型别,探讨MRSA菌株流行变化趋势及进化特点,为该地区MRSA的进一步防治提供科学依据。【方法】对86株MRSA进行葡萄球菌盒式染色体SCCmec基因、spa基因分型,并开展多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST),与国际上MRSA的流行型别进行比较,分析进化关系。【结果】86株MRSA共发现13个spa型(以t311型为主,占48.8%;其次为t6418型,占11.6%);MLST分型共发现9个ST型(以ST5为主,占59.3%;其次为ST239,占16.3%),经e BURST软件分析它们属于4个群(Group 1、Group 6、Group 8、Group 12)和8种克隆复合体(CC1、CC5、CC630、CC20、CC59、CC88、CC239、CC573);SCCmec基因分型以SCCmecⅡ型为主,占61.6%;其次为SCCmec III型,占22%;5株社区相关性MRSA(SCCmec-Ⅳ型)。其中第一流行克隆型为SCCmec-Ⅱ-ST5-t311-CC5(占47.7%)、其次为SCCmec-III-ST239-t030/t037-CC239(占12.8%)。【结论】SCCmec-Ⅱ-ST5-t311为杭州地区当前流行菌株;CA-MRSA菌株的出现,提示MRSA菌株有由医院向社区播散的趋势;此外,对新发展了单位点变体的菌株(SCCmec-Ⅰ-ST1921-t164-CC20和SCCmec-Ⅳ-ST965-t062-CC5),应加强重视。

RT-PCR检测金黄色葡萄球菌

目的探讨检测金黄色葡萄球菌及其活菌的RT-PCR方法。方法用RT-PCR方法对金黄色葡萄球菌的spa基因进行检测,并做灵敏度和特异性测定,用RT-PCR检测细菌灭活前后的spa基因。结果用spa基因检测金黄色葡萄球菌灵敏度为1.5×104CFU/mL;Spa引物能特异性扩增出金黄色葡萄球菌的标准株和14株临床株的目的片段,对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和化脓性链球菌则无特异性扩增条带,而对白色念珠菌有较弱条带扩出;细菌灭活前可以检测出目的基因,灭活后4℃放置24、48和72 h均无目的基因片段扩出。结论可以用spa基因对金黄色葡萄球菌进行活菌检测。