猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体的构建

本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞(ST)中的干扰作用。利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子,构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性;根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成3条siRNA序列,通过脂质体转染至ST细胞,利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率;基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA,构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6的干扰效果。结果表明,成功构建重组质粒ACEpIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性;各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用,以siRNA-3的作用最佳。siRNA-3转染48 h后,SPAG6蛋白表达量显著下降(P<0.001),成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列;成功构建重组质粒ACE-shSPAG6-pcDNA3.1,转染ST细胞48h后SPAG6蛋白表达量较阴性对照组显著下调(P<0.001)。本研究成功构建了猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体,并在ST细胞中验证了其具有较好的干扰效果。

Spag6调控运动纤毛结构功能缓解大鼠缺血性脑水肿损伤

目的 研究精子相关抗原6(sperm-associated antigen 6,Spag6)对缺血性脑水肿介导的突触损伤的影响。方法 将90只SD大鼠随机分为3组:假手术组、模型组和Spag6组。利用慢病毒感染上调大鼠脑内Spag6蛋白表达后,用大脑中动脉栓塞法构建缺血性脑水肿模型。利用Longa评分进行神经功能评价;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评估脑梗死体积;苏木精-伊红(HE)染色法、扫描电镜观察运动纤毛结构活性;透射电镜观察神经细胞超微结构;Western blot检测Bcl-2、Bax、Survivin、GluN1、GluN2B和GluA2蛋白表达水平。结果 模型组大鼠大脑不同区域神经细胞和组织损伤,Spag6表达异常变化,突触结构功能改变;第三脑室运动纤毛活性紊乱,发生缺血性脑水肿现象。上调Spag6表达后,脑水肿现象缓解,运动纤毛活性恢复;缺血区脑梗死、神经细胞损伤及突触结构异常改变被逆转;Bcl-2、Survivin、GluN1、GluN2B、GluA2的蛋白表达显著升高(P<0.01或P<0.05),Bax表达量均降低(P<0.01)。结论 Spag6通过恢复脑室运动纤毛的活性状态,增强突触的功能,进而减轻缺血性脑水肿介导的神经损伤。

SPAG5在胃癌细胞恶性增殖中的生物学作用

目的在胃癌组织及癌旁组织中分析SPAG5的表达情况,通过干扰SPAG5分析其在胃癌细胞生长中的生物学作用。方法结合TCGA分析,免疫组织化学、免疫荧光染色分析SPAG5及MKi67在胃癌及癌旁组织中的表达模式,利用胃癌细胞AGS和MGC803进行体外细胞生物学实验,分别设置空白对照组和干扰组,采用慢病毒干扰,其中空白对照转染shCtrl,干扰组转染shSPAG5。通过Celigo、MTT和克隆形成实验、凋亡检测分析敲减SPAG5基因后对胃癌细胞生长的影响。结果Proteinatlas数据库、TCGA数据库分析结果发现SPAG5在胃癌中高表达,KM-plot及GEPIA数据库分析SPAG5在肺腺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、膀胱癌中高表达,免疫组化发现SPAG5在胃癌中高表达(P<0.001),免疫组化和免疫荧光共聚焦证明SPAG5与MKi67存在显著相关性(R=0.393,P<0.001)。Real time-PCR及Western blotting结果显示SPAG5在MKN74、BGC823、MGC803、SGC7901和AGS等细胞中表达水平较高(P<0.01)。敲减SPAG5后mRNA和蛋白的表达下降,Celigo、MTT和克隆形成实验结果显示敲减SPAG5抑制胃癌细胞增殖(P<0.01),流式凋亡分析发现敲减SPAG5促进胃癌细胞凋亡(P<0.001)。结论SPAG5和MKi67在胃癌组织中的表达具有相关性,干扰SPAG5基因可以抑制胃癌细胞的增殖。SPAG5与患者预后相关,可能成为胃癌的潜在标志物。

精子相关抗原9(SPAG9)在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的研究乳腺癌患者组织中精子相关抗原9（spermassociated antigen9，SPAG9）和血清中SPAG9抗体的表达水平，了解其对乳腺癌诊断的价值。方法免疫组化（immunohistochemistry，IHC）法检测40例乳腺癌患者病灶及其癌旁组织中SPAG9表达水平，分析SPAG9表达水平与临床病理分期（tumor node metastasisstage，TNM）的关系。酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测53例初诊乳腺癌、48例良性病变和43例健康对照血清SPAG9抗体浓度，分析血清SPAG9抗体浓度与患者临床指标的关系；并绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，评价血清SPAG9抗体对乳腺癌诊断的价值及意义。结果乳腺癌病灶组织中SPAG9蛋白表达高于癌旁组织，二者差异有统计学意义（P=0．000）。乳腺癌血清SPAG9抗体浓度[10．22（5．055～16．660）mU／m1]显著高于良性病变组[6．666（3．369～11．517）mU／m1]（P〈0．05）和健康对照组[5．079（2．857～8．571）mU／m1]（P=0．000），且与年龄和TNM分期明显有关。ROC曲线下面积（areaunder the curve，AUC）为0．715，得出SPAG9抗体最佳临界值为10．185mU／ml时，SPAG9抗体诊断乳腺癌的敏感度为50．9％，特异性为88．4％。结论SPAG9及其抗体在乳腺癌病灶组织和血清中高表达，血清SPAG9抗体对乳腺癌诊断具有一定的价值。

精子相关抗原SPAG9在人精液精子中的表达及定位

目的:SPAG9作为MAPK家族中的成员,在精卵融合过程中发挥着重要的作用。本研究检测SPAG9在人精液精子中的表达情况。方法:取人不同组织(肌肉、肝、食管、肺、胃、肾、前列腺、子宫、睾丸、附睾)标本及健康男性的精液精子,为了排除圆形细胞的污染,精液标本经非连续性Percoll梯度离心、分离纯化;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和间接免疫荧光方法,从mRNA和蛋白水平检测SPAG9在精子中的表达。结果:RT-PCR结果显示,SPAG9mRNA不仅在各种不同的组织中有表达,而且在人精液精子中也有表达;间接免疫荧光结果显示,SPAG9蛋白主要定位于人精液精子头部的赤道板和精子尾部鞭毛上。结论:SPAG9在人精液精子中有表达,可能在精子获能和运动中有一定作用。

利用精子特异性抗体SPAG8分离混合细胞体系中的精子

目的利用精子特异性抗体SPAG8(Sperm associated antigen 8)结合免疫磁珠技术分离混合细胞系中的精子,建立混合斑中精子细胞分离的新方法。方法制备含有精子103、104、105/mL与阴道上皮细胞104/mL的3种混合悬液各10例,各样本制作混悬液及模拟混合斑各2份,分别以生物素标记的SPAG8单克隆抗体孵育特异结合混合悬液及混合斑中的精子,然后用亲和素包被的免疫磁珠通过生物素-亲和素复合体捕获分离精子细胞,提取精子DNA进行STR复合扩增和DNA分型检测,同时以差异裂解法检测混悬液及混合斑中的精子进行方法比较。结果免疫磁珠-亲和素-生物素-抗体复合物可分离混合细胞体系中的精子,当混合悬液内的精子数量达到103/mL时,90%的样本可得到13个STR基因座的单一男性分型,精子数量达到104/mL时,90%的样本均可得到16个STR基因座的单一男性分型;含有104/mL以上数量精子的混悬液制作的混合斑,单一男性13个STR基因座的正确分型率达80%以上,混悬液及混合斑的免疫磁珠法有效STR检出率高于传统的差异裂解法。结论本方法简便快捷,可作为混合斑法医学检验的有效补充手段。

人睾丸新基因SPAG4L的原核表达与纯化

目的原核表达人睾丸生精相关基因SPAG4L,并对重组蛋白进行纯化,为下一步研究SPAG4L的生物学功能奠定基础。方法运用RT-PCR从人睾丸中扩增编码SPAG4L126-379的基因片段,并将PCR产物克隆至pUCm-T载体。用限制性内切酶EcoR I和Hind III消化后,将目的片段克隆至带有6个组氨酸标签的原核表达载体PQE30中。重组质粒PQE-30-SPAG4L经酶切和测序验证后,转化大肠杆菌JM15,IPTG诱导融合蛋白表达。SPAG4L融合蛋白以westernblot进行鉴定,最后用NI-NTA磁性琼脂糖珠进行纯化。结果成功构建了重组表达质粒PQE-30-SPAG4L,并能够在大肠杆菌JM15中诱导表达,经Western blot分析证实,IPTG诱导表达的是SPAG4L融合蛋白。建立小规模的SPAG4L融合蛋白表达、纯化系统,获得了带有6个组氨酸标签的纯化的SPAG4L融合蛋白。结论成功地对人睾丸生精相关基因SPAG4L进行了体外原核表达,获得了纯化的融合蛋白蛋白,为进一步研究该蛋白在精子发生中的生物功能奠定了基础。

鸽SPAG6基因多态性与精子活力、体尺性状的相关性研究

为探讨鸽精子相关抗原6蛋白(SPAG6)基因单核苷酸多态性(SNPs)及其与鸽精子活力和体尺性状之间的关系,选择98只12月龄银王鸽,采用DNA直接测序法对SPAG6基因部分片段进行SNPs筛选。结果表明:在SPAG6基因编码区和非编码区分别发现2个和7个突变位点,其中G26789T位点BB基因型个体精子活力显著高于AB基因型(P<0.05),AA基因型个体胫长均值显著高于BB基因型(P<0.05);C16181G和C16336T位点与胫围显著相关(P<0.05),BB基因型为优势基因型;T27507C位点AA基因型个体胫围均值显著高于AB基因型(P<0.05);T30364C位点3种基因型个体胸宽差异显著,其中BB基因型为优势基因型(P<0.05)。由此可见,SPAG6基因与精子活力和体尺性状密切相关,可以作为银王鸽精子活力与体尺性状分子标记的候选基因。

SPAG9在结直肠腺瘤及结直肠癌中的表达及意义

目的探讨精子相关抗原9(Sperm-associated antigen 9,SPAG 9)在结直肠腺瘤及结直肠癌中的表达及意义。方法选取经临床病理诊断的结直肠癌标本及相应的癌旁组织69例,结直肠腺癌18例,结直肠正常组织20例,应用免疫组化法检测SPAG9在结直肠腺瘤及结直肠癌中的表达及分布情况,并结合结直肠癌的分级及临床指标进行分类比较。结果 SPAG9在结直肠腺瘤及结直肠癌标本中高表达,在正常结直肠及癌旁组织中不表达。SPAG9的表达与结直肠癌患者年龄、性别、血清CEA水平、淋巴结转移、组织分级均无明显的相关关系,而与临床分期有统计学意义;在早期结直肠癌为I+II(92.7%)、进展期结直肠癌为III+IV(64.3%)(P<0.05)。结论 SPAG9在结直肠腺瘤及结直肠癌标本中高表达,SPAG9表达与临床期别有关,SPAG9在肿瘤的临床早期阶段(I和II期)表达的密切关系,表明SPAG9可能在肿瘤早期扮演一个重要的作用。SPAG9作为一种新型的生物标志物,可用于癌症的早期检测和诊断。

泰勒焦虫表面抗原TaSP、spag-1和Tams1基因片段克隆与序列分析

为了解泰勒焦虫表面抗原基因特性,利用PCR方法对实验室保存的泰勒焦虫细胞表面抗原spag-1、Tams1和TaS部分基因片段进行克隆与序列分析。PCR结果显示所扩增的spag-1、Tams1和TaSP部分基因长度分别为372bp,324bp和321bp。系统发育树分析表明,与本次测序表面抗原TaSP和Tams1基因片段同源性最高的虫株登录号分别为FJ895154和AF214797的泰勒焦虫株,同源性分别高达100%与99.69%;与spag-1基因片段同源性最高的虫株登录号为X78188、XM949884和M63017,它们之间同源性为100%。

Spag6L基因表达抑制对小鼠精母细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨Spag6L基因在小鼠精子发生中的表达情况以及抑制其表达对GC-2 spd精母细胞增殖和凋亡的影响。方法:提取出生后第8、16、20、28、42天的小鼠睾丸组织RNA,采用逆转录PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)检测分析Spag6L基因的表达情况;制备干扰Spag6L基因表达的慢病毒并转染GC-2 spd细胞;qPCR法筛选有效抑制Spag6L基因表达的稳定细胞株;采用细胞计数板和流式细胞术分析Spag6L基因表达抑制对GC-2 spd细胞增殖活性、凋亡和细胞周期的影响;Western印迹检测Spag6L基因沉默对促凋亡因子Bax及抗凋亡因子Bcl-2表达的影响。结果:小鼠出生后第8天睾丸组织中Spag6L基因少量表达,且随睾丸发育而逐渐升高;与对照组相比,GC-2 spd细胞中抑制Spag6L基因表达导致细胞活性降低(P<0.01),细胞阻滞于G1期,并且Bax蛋白表达显著升高而Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01),诱导细胞凋亡。结论:Spag6L基因通过调节精母细胞的细胞周期、增殖和凋亡,参与小鼠精子发生。

SPAG6基因RNAi慢病毒载体的构建及其对SKM-1细胞凋亡的影响

目的构建SPAG6-shRNA慢病毒载体靶向沉默SPAG6基因,探讨SPAG6基因沉默对人骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞株SKM-1细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并构建3条针对SPAG6基因的shRNA质粒表达载体,共转染293T细胞后得到可表达SPAG6基因RNAi的慢病毒载体。转染SKM-1细胞,利用流式细胞术检测转染效率,qRT-PCR及Western blot验证SPAG6基因干扰效果,筛选最佳靶点。CCK-8法检测SPAG6基因沉默对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建SPAG6-shRNA慢病毒载体,流式细胞术检测转染效率均在60%以上。qRT-PCR及Western blot检测结果显示SPAG6-shRNA3慢病毒载体敲除效率最高,为最佳靶点。SPAG6基因干扰后,干扰组SKM-1细胞的增殖明显受抑,抑制率为(60.18±0.37)%,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。干扰组SKM-1细胞凋亡率为(16.32±5.80)%,显著高于阴性对照组[(4.28±0.88)%,P=0.024]及空白对照组[(3.08±1.50)%,P=0.019]。结论 SPAG6-shRNA慢病毒载体能有效降低SPAG6基因表达水平,抑制SKM-1细胞增殖并促进其凋亡。

肿瘤患者自身抗体抗SPAG9在外周血中的表达研究

目的:通过对肿瘤患者血清中抗原9(SPAG9)的自身抗体的检测,了解患者外周血中抗SPAG9自身抗体的表达情况。方法:利用SPAG9重组,确立ELISA检测肿瘤患者血清中抗SPAG9抗体的有效性,从而了解由SPAG9所诱发的患者体液免疫反应。采用的判断标准为:参照组血清中抗SPAG9抗体0D的均值加2倍SD作为阳性。结果:研究的90例肿瘤患者中,血清SPAG9免疫反应总体阳性率为32.3%,肝癌组阳性率为33.3%,肺癌组阳性率为17.9%,其他肿瘤组阳性率为50%,健康对照组为33.3%。结论:SPAG9自身抗体在不同的肿瘤患者外周血中有着不同程度的表达,此次研究具有一定的医学价值。

SPAG9mRNA在DAC干预A549细胞前后的表达

目的检测DAC干预前后A549细胞中SPAG9的表达,探讨SPAG9表达的生物学机制。方法实时荧光定量PCR(RQ-PCR)法检测肺组织标本和DAC干预A549细胞前后SPAG9mRNA的转录情况。结果 DAC干预A549细胞前后SPAG9的表达差异性显著,随甲基化状态的延长而减弱。结论低甲基化状态抑制SPAG9表达。SPAG9在肺癌的早期高度表达,中晚期表达减弱,可作为肺癌早期诊断和治疗的生物学参考指标之一。

SPAG5在原发性乳腺癌中的表达与TEC方案新辅助化疗敏感性的关系

目的观察精子相关抗原5(SPAG5)在乳腺癌组织中的表达,探讨其表达情况与临床病理因素及TEC方案(T:多西他赛,E:表柔比星,C:环磷酰胺)新辅助化疗疗效之间的关系。方法收集107例接受TEC方案新辅助化疗的乳腺癌患者化疗前的组织标本,通过免疫组织化学法检测各标本中SPAG5蛋白的表达,结合临床病理因素及新辅助化疗疗效进行分析。结果 107例原发性乳腺癌组织中SPAG5蛋白高表达率48.6%(52/107),与人类表皮生长因子受体2过表达呈正相关性(P=0.000),与细胞增殖核抗原过表达呈正相关性(P=0.019)。SPAG5的表达在患者年龄、肿瘤大小、肿瘤分期、组织学分级、淋巴结状况、雌激素受体及孕激素受体的表达情况中均差异无统计学意义。化疗总体客观缓解(OR)率为70.1%(75/107),其中病理完全缓解(p CR)率9.3%(10/107),SPAG5高表达组OR率为82.7%(43/52),低表达组56.1%(32/57),差异有统计学意义(P=0.006)。SPAG5高表达组p CR率为15.4%(8/44),SPAG5低表达组p CR率为3.6%(2/53),差异有统计学意义(P=0.048)。结论 SPAG5作为肿瘤增殖指标,其表达状态对于乳腺癌患者TEC方案新辅助化疗的疗效具有预测作用。

SRSF3调控口腔癌细胞中SPAG5外显子3的可变剪切的研究

目的:研究调控前体mRNA(pre-mRNA)可变剪切的原癌基因SRSF3对细胞有丝分裂的重要功能蛋白SPAG5的外显子3的可变剪切的调控作用。方法:在人口腔鳞状上皮细胞癌细胞系CAL 27中应用RNAi技术降低SRSF3的表达,通过逆转录PCR(RT-PCR)检测SPAG5外显子3的可变剪切。结果:在CAL 27细胞中抑制SRSF3表达时,抑制了全长的SPAG5的表达,增加了较短的SPAG5的剪切异构体的表达。结论:SRSF3可以调控SPAG5外显子3的可变剪切,并可能影响了SPAG5蛋白的表达水平和有丝分裂。

SPAG5低表达与早期卵巢高级别浆液性癌患者预后关系

【目的】探讨SPAG5对卵巢高级别浆液性癌细胞生长及紫杉醇药物敏感性的影响,分析原发灶组织中表达水平差异与患者预后关系。【方法】体外实验中通过瞬时敲降卵巢腺癌细胞株中SPAG5,紫杉醇处理细胞后,MTT法检测细胞活力及绘制细胞生长曲线,研究SPAG5对细胞生长增殖及紫醇敏感性的影响;然后通过免疫组织化学染色,研究110例患者组织中SPAG5表达水平与患者预后的关系。【结果】SKOV3细胞中敲降SPAG5后发生细胞周期G2/M期阻滞,使细胞生长明显受抑;免疫组织化学染色显示,12例接受新辅助化疗患者肿瘤组织中SPGA5表达明显升高,对于未接受新辅助化疗患者,SPAG5低表达者疾病无进展生存较差,早期患者中差异更显著,患者总生存也有相似趋势,但差异无统计学意义;在卵巢腺癌细胞株OVCAR3 A2780及SKOV3中敲降SPAG5后,细胞对0.5μmol/L紫杉醇抵抗能力增强。【结论】SPAG5在卵巢腺癌细胞中调控细胞周期,促进细胞增殖,但早期卵巢高级别浆液性癌患者中SPAG5低表达者对紫杉醇的药物作用敏感性差,相应预后差,因此卵巢高级别浆液性癌辅助化疗方案应个体化选择。

SPAG9在肺癌中的表达

目的检测SPAG9在肺癌中的表达情况,初步探讨与肺癌临床特征的关系。方法实时荧光定量PCR法检测肺组织标本SPAG9 mRNA的转录情况,用免疫印迹(Western Blot)法检测肺组织标本SPAG9的蛋白质表达。结果①SPAG9在肺癌组织中高表达(21/27,77.78%),在肺良性疾病组织、癌旁组织均无表达。②SPAG9在肺癌中表达与肺癌的分化程度、TNM分期、淋巴结有无转移相关(P<0.05)。结论SPAG9在肺癌中高表达,与肺癌的病理特征相关,SPAG9可以作为肺癌早期诊断和治疗的一个新的生物学参考指标。

SPAG6在骨髓增生异常综合征患者中的表达及其基因启动子甲基化状态

目的探讨SPAG6在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者中的表达水平与临床参数相关性以及基因启动子甲基化状态对SPAG6转录调控的影响。方法采用RT-qPCR及Western blot检测18例MDS及MDS-AML患者和20例健康对照者骨髓细胞SPAG6表达水平;甲基化特异性PCR(MS-PCR)法检测MDS患者和对照组(包括初诊缺铁性贫血患者和健康体检人群)SPAG6启动子甲基化状态;分析SPAG6启动子甲基化状态及表达水平与患者临床参数相关性。结果与健康对照组比较,MDS患者SPAG6表达水平明显升高,且SPAG6启动子区域呈现异常低甲基化(P<0.01)。SPAG6表达水平与患者年龄、骨髓原始细胞比例、危险分层有相关性(P<0.05),与患者性别无相关性(P>0.05)。SPAG6基因启动子异常低甲基化状态与患者年龄、疾病危险分层有相关性(P<0.05),与患者性别、骨髓原始细胞比例无相关性(P>0.05)。结论 SPAG6在MDS患者中高表达,并且与疾病发生、进展以及不良预后相关,表观遗传调控可能是SPAG6转录调控的重要机制之一。

SPAG9 mRNA、Livin mRNA、Caspase-9 mRNA在曼月乐环疗程中动态变化及意义

目的探讨精子相关抗原9(SPAG9)mRNA、凋亡蛋白抑制因子(Livin)mRNA、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)m RNA在子宫内膜增生类病变患者曼月乐环疗程中动态变化及意义。方法选取2017年6月至2020年5月本院收治的126例子宫内膜增生类病变患者,根据治疗后6个月病理结果分为缓解组(n=101)、非缓解组(n=25),比较两组SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA表达水平、月经失血图(PBAC)评分、子宫内膜厚度,并对数据进行统计分析。结果缓解组治疗后3、6个月SPAG9、Livin mRNA、PBAC评分、子宫内膜厚度低于非缓解组,Caspase-9 mRNA高于非缓解组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后3、6个月SPAG9、Livin m RNA与PBAC评分、子宫内膜厚度呈正相关(P<0.05),Caspase-9mRNA与PBAC评分、子宫内膜厚度呈负相关(P<0.05);治疗后6个月SPAG9、Livin mRNA、Caspase-9mRNA预测缓解的AUC依次为0.843、0.831、0.772,各指标联合预测缓解的AUC为0.902(P<0.05)。结论EAH和EEC曼月乐环疗程中子宫内膜组织SPAG9、Livin mRNA降低及Caspase-9 mRNA升高是治疗有效的一种反映,可预测患者受益情况,有助于及时指导调整治疗方案。