SPAG6基因RNAi慢病毒载体的构建及其对SKM-1细胞凋亡的影响

目的构建SPAG6-shRNA慢病毒载体靶向沉默SPAG6基因,探讨SPAG6基因沉默对人骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞株SKM-1细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并构建3条针对SPAG6基因的shRNA质粒表达载体,共转染293T细胞后得到可表达SPAG6基因RNAi的慢病毒载体。转染SKM-1细胞,利用流式细胞术检测转染效率,qRT-PCR及Western blot验证SPAG6基因干扰效果,筛选最佳靶点。CCK-8法检测SPAG6基因沉默对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建SPAG6-shRNA慢病毒载体,流式细胞术检测转染效率均在60%以上。qRT-PCR及Western blot检测结果显示SPAG6-shRNA3慢病毒载体敲除效率最高,为最佳靶点。SPAG6基因干扰后,干扰组SKM-1细胞的增殖明显受抑,抑制率为(60.18±0.37)%,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。干扰组SKM-1细胞凋亡率为(16.32±5.80)%,显著高于阴性对照组[(4.28±0.88)%,P=0.024]及空白对照组[(3.08±1.50)%,P=0.019]。结论 SPAG6-shRNA慢病毒载体能有效降低SPAG6基因表达水平,抑制SKM-1细胞增殖并促进其凋亡。

SPAG6在骨髓增生异常综合征患者中的表达及其基因启动子甲基化状态

目的探讨SPAG6在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者中的表达水平与临床参数相关性以及基因启动子甲基化状态对SPAG6转录调控的影响。方法采用RT-qPCR及Western blot检测18例MDS及MDS-AML患者和20例健康对照者骨髓细胞SPAG6表达水平;甲基化特异性PCR(MS-PCR)法检测MDS患者和对照组(包括初诊缺铁性贫血患者和健康体检人群)SPAG6启动子甲基化状态;分析SPAG6启动子甲基化状态及表达水平与患者临床参数相关性。结果与健康对照组比较,MDS患者SPAG6表达水平明显升高,且SPAG6启动子区域呈现异常低甲基化(P<0.01)。SPAG6表达水平与患者年龄、骨髓原始细胞比例、危险分层有相关性(P<0.05),与患者性别无相关性(P>0.05)。SPAG6基因启动子异常低甲基化状态与患者年龄、疾病危险分层有相关性(P<0.05),与患者性别、骨髓原始细胞比例无相关性(P>0.05)。结论 SPAG6在MDS患者中高表达,并且与疾病发生、进展以及不良预后相关,表观遗传调控可能是SPAG6转录调控的重要机制之一。

Spag6L基因真核表达质粒的构建及细胞内的蛋白表达与定位

目的:构建小鼠Spag6L基因真核表达质粒,并研究其在细胞内的表达与定位。方法:以小鼠睾丸cDNA基因文库为模版,PCR扩增Spag6L基因全长序列,测序正确后亚克隆至pEGFP-N2和pcDNA3真核表达载体中并酶切鉴定,将构建成功的重组表达质粒转染至COS-7与CHO细胞中,Western blot法检测COS-7细胞中SPAG6L蛋白表达,激光共聚焦扫描显微镜观察SPAG6L蛋白在CHO细胞内的定位。结果:重组质粒pEGFPSpag6L和pcDNA3-Spag6L经双酶切后产生的1.5kb的目的插入片段,经测序证实与Spag6L基因一致。GFPSPAG6L融合蛋白分子质量为82kU,SPAG6L蛋白分子质量为56kU。SPAG6L蛋白在CHO细胞中主要定位于细胞质,以微管和囊泡表达为主。结论:构建的pEGFP-Spag6L和pcDNA3-Spag6L真核表达质粒成功,为进一步探究Spag6L基因与Spag6基因的关系以及Spag6L基因在精子发生中的功能与作用奠定了基础。