表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表达及多克隆抗体制备

目的:制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1基因截短蛋白多克隆抗体,为FAdV-4病的诊断、检测及致病机制研究奠定基础。方法:对FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株Fiber-1基因序列(MG148335.1:30459-31754)进行信号肽、疏水性和抗原决定簇分析,截取具有较高免疫原性的片段,设计合成特异性引物,以CH/AHMC/2015分离株基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得截短Fiber-1(sFiber-1)基因片段,将其连接至原核表达载体pET-32a,验证后转化至大肠杆菌BL21感受态中,诱导表达sFiber-1蛋白。纯化后的蛋白与佐剂乳化后免疫SD大鼠,制备多克隆抗体,并测定多克隆抗体效价。用Western-blot检测抗体免疫原性。结果:成功构建了sFiber-1的原核表达载体,获得FAdV-4的sFiber-1重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定,重组sFiber-1蛋白大小约为52 kDa,主要以包涵体形式表达;间接ELISA法测得sFiber-1多克隆抗体效价为1∶2^(13);Western blot结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别出重组sFiber-1蛋白。结论:本研究成功表达了FAdV-4的重组sFiber-1蛋白,制备了具有较高免疫活性的sFiber-1多克隆抗体,可为FAdV-4的检测及诊断奠定基础。

SPARCL1在动脉粥样硬化斑块形成中的作用研究

目的探讨富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1(SPARCL1)对动脉粥样硬化(AS)斑块形成的影响。方法采用病例对照研究,选取394例AS确诊患者作为病例组,年龄、性别相匹配的394例健康对照者作为对照组。利用酶联免疫吸附试验测定血清SPARCL1表达水平;免疫组织化学实验评估SPARCL1蛋白在AS斑块区的表达水平及定位,同时检测AS患者和正常对照人群外周血的中性粒细胞及单核细胞的SPARCL1蛋白表达情况;构建SPARCL1过表达及抑制表达的重组腺病毒载体,以小鼠巨噬细胞(J774A.1)为靶细胞,进行细胞划痕实验观察SPARCL1对细胞迁移的影响。结果AS患者组的血清SPARCL1水平低于健康组(P<0.05);在AS斑块中检测到SPARCL1高表达,且主要表达在泡沫细胞胞浆;AS患者的外周血中性粒细胞及单核细胞SPARCL1表达水平低于正常对照(P<0.05);SPARCL1过表达及抑制表达的重组腺病毒构建成功;抑制SPARCL1表达的J774A.1细胞中的细胞迁移率降低,过表达SPARCL1的J774A.1细胞中的细胞迁移率增加(P<0.05)。结论SPARCL1在AS病变部位泡沫细胞高表达,这可能来自于外周血单核细胞和中性粒细胞的代偿性募集,SPARCL1可能作为血管保护因子参与抑制AS斑块的发生发展。

沉默DKK1、Sost重组腺病毒载体的构建及其对MG63细胞增殖、ALP活性和钙离子浓度影响研究

目的构建Wnt信号通路抑制因子Dickkopf1(DKK1)、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)基因沉默重组腺病毒载体,观察其对MG63细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性和钙离子浓度影响作用。方法设计出特异性针对DKK1、Sost和无关对照序列(Scr),构建DKK1、Sost沉默重组腺病毒载体,用q PCR法和蛋白印记(Western blot)法选出沉默效率最好的扩增DKK1、Sost沉默重组腺病毒载体,并用荧光显微镜观察计算病毒滴度。MG63细胞被分成空白对照组、沉默DKK1(Ad-sh DKK1)组、沉默Sost(Ad-sh Sost)组、沉默DKK1+Sost(Ad-sh DKK1+Ad-sh Sost)组4组,分别用优选出的沉默效率最好的sh DKK1和sh Sost腺病毒载体转染MG63细胞,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)检测观察细胞增殖、考马斯亮蓝蛋白定量法测定ALP活性、流式分析法测定钙离子浓度。结果 1DKK1 p Ad-sh DKK1-1和Sost p Ad-GFP-shRNA-2沉默效率最高;2与空白对照组对比,沉默DKK1组、沉默Sost组、沉默DKK1+Sost组的细胞光吸收值(OD)、ALP活性测定值均升高,而钙离子浓度均降低,以沉默DKK1+Sost组变化最明显,组间比较具有统计学差异(P<0.01和P<0.05)。结论 DKK1、Sost沉默可促进MG63细胞增殖、提高ALP活性,降低钙离子浓度,尤以二者同时沉默时的作用最强。

血清4型禽腺病毒胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立对血清4型禽腺病毒(FAdV-4)进行快速检测的胶体金免疫层析法,将FAdV-4的hexon-L1蛋白进行原核表达,免疫兔制备多克隆抗体,将多抗包被在检测(T)线,将羊抗兔IgG包被在质控(C)线,用胶体金标记的多抗作为示踪剂,制备胶体金免疫层析检测卡,用于检测FAdV-4抗原,并对其敏感性和特异性进行评价,用其检测临床样本并与PCR检测结果相比较。结果显示,制备的胶体金检测卡可检出FAdV-4含量为10^(2.094)^(5)EID_(50),FAdV-8、新城疫病毒、禽白血病病毒等均不出现特异性条带,对临床样本的检测与PCR检测的符合率达98%。建立的胶体金检测方法可用于FAdV-4感染的快速检测。

人心肌营养素-1重组腺病毒载体的构建、纯化及表达

目的 构建人心肌营养素 1重组腺病毒载体 ,以期用于神经系统退行性疾病及损伤的在体研究。方法 构建穿梭质粒pDC3 16 huCT1和pDC3 16 eGFP ,CsCl梯度离心制备高纯度的病毒基因组质粒pBHloxdeltaE1,3Cre、pHG14 0。培养2 93细胞 ,CaCl2 法质粒共转染 2 93细胞构建并筛选腺病毒AdCMV huCT1和AdCMV eGFP。病毒原液转染 2 93细胞及NIH3T3细胞 ,PCR、RT PCR及免疫组化鉴定。CsCl梯度离心纯化病毒 ,空斑试验检测病毒滴度。纯化病毒注入大鼠颈脊髓 ,RT PCR及免疫组化检验AdCMA huCT的在体表达。结果 采用双质粒共转染 2 93细胞Cre loxP位点同源重组方法构建了E1和E3缺失的含MCMV启动子、外源基因和SV40PloyA的AdCMV huCT1和AdCMV eGFP载体。经过PCR、RT PCR和免疫组化证实腺病毒载体构建成功。病毒经过CsCl梯度离心纯化后 ,AdCMV huCT1滴度达到 3 .0× 10 1 0 pfu。RT PCR及免疫组化显示AdCMV huCT1在大鼠脊髓中特异性表达。结论 构建并纯化了体外及体内高效表达的AdCMV huCT1。

表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的HA基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5 HA-EGFP。采用Ad-Max同源重组系统和共转染技术,构建了表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-H5 HA-EGFP)。经目的基因PCR检测及序列测定,结果表明:HA基因已经正确地插入到腺病毒的基因组中;通过RT-PCR检测与Western blot分析,结果表明:HA基因能够进行正确转录,并且所表达的蛋白具有相应的生物学活性。子代重组腺病毒rAd-H5 HA-EGFP经增殖、纯化后感染性滴度可达2.26×1010TCID50mL-1。rAd-H5 HA-EGFP免疫BALB/c小鼠能够诱导特异性的HI抗体产生,有效阻止病毒在体内的复制。

重组人干扰素-α1b吸入联合免疫球蛋白对重症腺病毒肺炎患儿细胞免疫功能的影响

目的观察重组人干扰素α1b(rhIFN-α1b)吸入联合免疫球蛋白对重症腺病毒肺炎患儿细胞免疫功能的影响。方法选取2019年8月—2020年8月湖南省儿童医院呼吸内科诊治重症腺病毒肺炎患儿82例,按照抽签法随机分为对照组和联合组各41例,对照组予基础治疗+rhIFN-α1b吸入治疗,联合组在对照组基础上给予免疫球蛋白治疗,2组均连续治疗7 d。流式细胞仪检测T细胞(CD3、CD4、CD8)水平,酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子(TNF)、γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)水平,比较2组治疗效果、临床症状缓解时间、不良反应发生率。结果联合组治疗总有效率高于对照组,差异有统计学意义(90.24%vs.73.17%,χ^(2)/P=3.998/0.046)。联合组发热、肺部啰音、咳嗽、憋喘、咯痰等缓解时间均短于对照组(t/P=17.810/0.001、74.590/0.001、16.280/0.001、27.530/0.001、18.400/0.001);治疗后2组CD3、CD4、CD8水平均较治疗前升高,且联合组较对照组明显升高(t/P=10.870/0.001、4.367/0.001、2.362/0.021);治疗后2组TNF、IFN-γ、IL-2水平均较治疗前降低,且联合组较对照组明显下降(t/P=6.482/0.001、10.500/0.001、15.340/0.001)。2组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论rhIFN-α1b吸入联合免疫球蛋白对重症腺病毒肺炎患儿治疗效果显著,能提高其细胞免疫功能,控制患儿病情发展,改善其临床症状,促进患儿早日康复。

新孢子虫与弓形虫交叉抗原AMA1基因重组腺病毒的构建及免疫应答分析

为构建新孢子虫和弓形虫AMA1基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,本试验根据新孢子虫和弓形虫AMA1基因序列的开放阅读框,设计新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因通用引物,构建重组克隆质粒pMD18T-NcAMA1、pMD18T-TgAMA1及重组腺病毒穿梭质粒ADV4-Nc/TgAMA1,将ADV4-Nc/TgAMA1和骨架质粒pacAd5线性化后共转染293T细胞,包装Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒,测定病毒滴度后,收集病毒液接种BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平。结果显示,Nc/TgAMA1在Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒中获得表达,测定Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒滴度为109 PFU/mL,接种BALB/c小鼠后,Ad5-Nc/TgAMA1接种组IgG抗体水平明显高于pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组和PBS对照组。结果表明,构建的Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。本试验为新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础。

人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,并观察其对HepG2细胞的转染情况。方法采用基因工程技术,经过亚克隆将人HIF-1α基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,经脂质体转染HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装、扩增。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HepG2细胞感染效率的监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明重组腺病毒载体成功,人HIF-1α重组腺病毒滴度达1.15×1010pfu/ml,阴性对照腺病毒的滴度为8×1010pfu/ml,并对HepG2细胞具有很强的感染力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含人HIF-1α基因的重组腺病毒载体。

重组腺病毒介导的人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因在肝癌细胞中的表达

目的 观察腺病毒载体对肝癌细胞的转染效率及其介导的人野生型 p5 3、GM CSF和B7 1基因在肝癌细胞中的表达。方法 不同MOI的Ad GFP感染肝癌细胞 ,48h后计算感染效率 ;BB 1 0 2以5 0MOI感染肝癌细胞 ,48h后免疫组化法及westernblot检测 p5 3表达 ,ELISA检测GM CSF的含量 ,FACS测定B7 1的表达。结果 MOI为 5 0 pfu/细胞时对肝癌细胞的转染效率达 80 %以上 ,目的基因均可在肝癌细胞中高效表达。结论 腺病毒载体对肝癌细胞具有较高的转染效率 ,目的基因均可在肝癌细胞中高效表达 ,为进一步研究BB 1 0

细菌内同源重组快速构建和制备表达hSDF-1α的重组腺病毒

目的:利用细菌内同源重组快速构建携带hSDF-1αcDNA重组腺病毒质粒和制备表达hSDF-1α重组腺病毒.方法:制备感受态BJ5183,将pAdEasy-1转化BJ5183,制备含pAdEasy-1的BJ5183感受态,将线性化的pShuttle-EGFP-hS-DF-1α转化含pAdEasy-1的BJ5183感受态菌.采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α.pAd-EG-FP-hSDF-1α用PacI线性化后,再用LipoVec介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α.采用荧光显微镜下观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况.结果:pShuttle-EGFP-hSDF-1α成功地转化了含pAdEasy-1的BJ5183,并在其内发生了同源重组.荧光显微镜下观察证实了pAd-EGFP-hSDF-1α转染AD293后,产生了重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α.病毒滴度为4.1×1015pfu/L.结论:用细菌内同源重组法可快速、高效制备表达hSDF-1α的高滴度重组腺病毒.为研究hSDF-1α在动员骨髓源干细胞迁移到组织损伤部位修复组织损伤的研究奠定了基础.

人转录因子PU.1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 PU.1是调控肺泡巨噬细胞天然免疫功能的重要转录因子之一。文中旨在构建并鉴定表达人转录因子PU.1基因的重组腺病毒载体。方法将PU.1基因SPI1和真核表达载体p IRES-EGFP进行双酶切、连接酶连接,PCR扩增目的片段SPI1-IRES-EGFP,与中间质粒p DONR221和腺病毒骨架质粒p Ad/CMV/V5-DEST进行重组,线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,获得重组腺病毒p AD-SPI1-IRES-EGFP,经过大量扩增后获得高浓度的重组腺病毒。TCID 50法测定重组腺病毒滴度,通过荧光显微镜和实时荧光定量PCR(Real-time q PCR)鉴定PU.1基因在HEK293细胞中的表达。结果菌落PCR、酶切电泳及测序结果均表明重组腺病毒携带有正确的PU.1基因,TCID 50法计算腺病毒滴度为8×1011IU/m L,荧光显微镜下可见明显的绿色荧光,Real-time q PCR转染重组腺病毒组PU.1 mRNA表达量是转染空病毒组的2189.93倍。结论成功构建并获得了高浓度的人转录因子PU.1基因重组腺病毒,为后续研究高表达PU.1在宿主抗烟曲霉感染中的天然免疫作用奠定了基础。

小鼠MIP1-α重组腺病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 :构建小鼠趋化因子 MIP1-α(m MIP1-α)的重组腺病毒载体并在小鼠肝癌细胞中表达 ,为肝癌基因治疗提供实验基础。 方法 :PCR扩增含有 m MIP1-α的质粒 ,将腺病毒骨架质粒 p Ad Easy- 1以及线性化的重组穿梭质粒 p Track- CMV-m MIP1-α共转化 BJ5 183受体菌并在其中发生同源重组 ,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子 ,重组腺病毒质粒经过 2 93细胞的包装、扩增和纯化后 ,感染小鼠肝癌细胞株 Hepa1- 6 ,一步法提取细胞总 RNA,RT- PCR检测 m MIP1-α的 m RNA。琼脂糖凝胶打孔法体外观察感染上清中 m MIP1-α对小鼠脾细胞的趋化活性。 结果 :得到了携带 m MIP1-α的重组腺病毒 ,纯化后滴度为 4× 10 1 1 efu/ ml,在感染后的 Hepa1- 6细胞中检测到 m MIP1-α的表达 ,上清中 m MIP1-α的趋化指数为 6 .3。结论 :成功地构建了携带 m MIP1-α的重组腺病毒载体 ,为下一步应用于肝癌的基因治疗提供了基础。

重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α对血管新生的影响

目的研究重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α(Ad-HIF-1α-Ala564-Ala402-Ala803,简称Ad-HIF-1α-564/402/803)对体外血管新生的影响。方法将前期构建的Ad-HIF-1α-564/402/803在HEK293A细胞中进行扩增,用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化,终点稀释法测定病毒滴度,提取病毒DNA,进行PCR及PCR产物测序鉴定三突变型HIF-1α基因;X-Gal染色法测定重组腺病毒转染效率;Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null分别转染hMVECs后,观察hMVECs在Matrigel上毛细血管管腔样结构的形成情况;Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null和PBS分别转染鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型后,利用Image Pro Plus6.0软件收集数据并计算各组CAM血管面积比。结果经PCR及基因测序鉴定,扩增纯化后的腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或变异,病毒滴度达1011～1012PFU/ml;X-gal染色显示MOI为100pfu/cell时,转染效率趋于稳定;Ad-HIF-1α-564/402/803转染hMVECs后Matrigel上的管腔数目显著多于Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null及对照组;基因转染CAM72h后,Ad-HIF-1α-564/402/803组CAM上微小血管数目较Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null组、PBS组明显增多;Ad-HIF-1α-564/402/803组血管面积比与Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null组、PBS组相比,差异有统计学意义(P值分别为0.01、0.000、0.000)。结论Ad-HIF-1α-564/402/803能明显促进hMVECs毛细血管管腔样结构的形成,同时可以促进CAM模型上微小血管新生,证实了Ad-HIF-1α-564/402/803在常氧情况下对血管新生有一定的促进作用。

复制缺陷型重组腺病毒rvAdG1VP7免疫学效果的研究

目的 对 1株可表达A组轮状病毒主要结构抗原VP7的重组腺病毒rvAdG1VP7的体内免疫学效果进行研究。方法 通过灌胃和滴鼻 2种途径对BALB/c小鼠进行免疫 ,并对免疫后小鼠体液和黏膜免疫进行分析。结果 初次免疫后 ,2组小鼠均有应答 ,但血清IgG抗体滴度及阳转率不同。再次免疫后 ,显示出明显的加强效果。除了血清IgG外 ,小鼠还产生了较强的针对轮状病毒的血清IgA。滴鼻组在肺灌洗液和肠匀浆液中均可检测到SIgA ,灌胃组仅在肠道检测到SIgA。滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。对滴鼻组小鼠肺灌洗液IgG/SIgA的阳转率进行了比较 ,发现IgG的应答水平明显高于SIgA。免疫后小鼠血清中IgG的动态观察表明 ,抗体可长期持续至少半年以上。 结论 重组腺病毒载体rvAdG1VP7所取得的良好免疫学效果 ,为我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗的进一步研制奠定了基础。

重组腺病毒HIV-1 vpr基因的构建和表达

目的构建携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒,使CD4+T淋巴细胞C8166内源性的高表达Vpr蛋白。方法利用AdEasy-1系统,通过将含有目的基因片段的穿梭载体pAdTrack-CMV-vpr和骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒Ad-vpr,用脂质体法将重组质粒转染至HEK293A细胞包装,获得重组腺病毒Ad-vpr,荧光显微镜观察Ad-vpr感染C8166细胞GFP的表达,Western blotting鉴定Vpr在C8166细胞内的特异性表达,流式细胞术检测Ad-vpr感染C8166细胞的效率。结果成功构建携带HIV-1vpr基因的重组腺病毒,Western blotting结果表明重组腺病毒Ad-vpr感染的C8166细胞内源性的高表达Vpr蛋白,流式细胞术检测结果表明Ad-vpr感染C8166细胞效率高(44.07±3.62)%。结论成功构建出携带HIV-1vpr基因的重组腺病毒,使C8166细胞内源性的高表达Vpr蛋白。

p27kip1腺病毒重组体对人食管癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

背景:p27kip1是新近发现的一种抑癌基因,研究表明p27kip1基因转移能显著抑制食管癌和胃癌细胞生长,该基因疗法在体内实验中是否同样有效值得进一步研究。目的:研究p27kip1腺病毒重组体对人食管癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:将携带人p27kip1基因的重组腺病毒载体导入人食管癌裸鼠移植瘤中,测定肿瘤生长抑制率,免疫组化方法检测移植瘤中p27kip1和生存素(survivin)的表达。结果:经p27kip1基因治疗的裸鼠,肿瘤生长抑制率达64.1%,移植瘤中p27kip1呈高表达,生存素呈低表达。结论:p27kip1腺病毒重组体能显著抑制人食管癌裸鼠移植瘤的生长,上调p27kip1和下调生存素的表达可能是其重要作用机制。

共表达口蹄疫病毒VP1-2A基因与猪IL-2重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

构建共表达口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因和猪白细胞介素2(IL-2)基因的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。将FMDV VP1-2A基因和猪IL-2基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP中,在受体菌中与腺病毒骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3同源重组。重组腺病毒质粒转染HEK-293A细胞,得到重组腺病毒rAd5VP1-2A-Po IL-2。MTT法检测重组IL-2的生物活性。用rAd5VP1-2A-poIL-2免疫接种小鼠,同时设免疫单独表达FMDV VP1基因的重组腺病毒rAd5VP1和空腺病毒的对照组。通过检测淋巴细胞增殖功能,特异性抗体分泌,IL-4和IFN-γ的表达水平衡量rAd5VP1-2A-poIL-2对小鼠特异性免疫应答的影响。结果显示,成功获得了rAd5VP1-2A-poIL-2,MTT法检测重组IL-2具有生物学活性。小鼠免疫试验结果显示,与rAd5VP1免疫组相比,rAd5VP1-2ApoIL-2免疫既能增强重组病毒诱导小鼠淋巴细胞增殖的能力,又能提高重组病毒诱导小鼠特异性抗体的水平。细胞因子检测结果显示,串联IL-2能促进重组病毒诱导Th1和Th2的分化。研究结果说明,rAd5VP1-2A-poIL-2可望成为口蹄疫的候选疫苗。

表达牛冠状病毒S1基因的重组人腺病毒的构建及鉴定

为构建表达牛冠状病毒(BCV)S1基因的重组人腺病毒疫苗,本实验通过人工合成密码子优化的截短BCV S1的基因片段(55 bp～1 650 bp)。将其克隆到重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,并以PmeⅠ线性化后转化含有人5型腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞,通过细菌内同源重组的方式获得重组腺病毒质粒pAdV-BCV-S1,经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞获得重组腺病毒rAdV-BCV-S1。利用间接免疫荧光法和western blot法检测该重组腺病毒的S1基因在AD-293细胞中的表达情况,同时用一步生长曲线法,测定该重组腺病毒的复制能力。结果表明:BCV S1基因在感染细胞中获得了高效表达:子代重组腺病毒在感染细胞后60 h滴度最高,为6.8×108 pfu/mL。该重组腺病毒的构建为BCV重组疫苗的研究奠定了基础。