SPATA12基因在多种肿瘤中的组织芯片表达谱分析

为了检测生精相关基因SPATA12在多种肿瘤组织中的表达及其与临床病理特征的关系,采用数字虚拟Northern方法分析SPATA12在41种正常组织及其相应肿瘤组织中的表达丰度;利用组织芯片技术结合原位杂交的方法,对96例多器官肿瘤组织芯片和208例肺肿瘤组织芯片样本中SPATA12基因的表达情况进行检测.虚拟Northern结果显示,SPATA12主要表达于正常睾丸组织以及少部分肺癌组织中.组织芯片原位杂交结果显示,SPATA12在多种肿瘤组织中表达频率不一,主要在皮肤恶性黑色素瘤、前列腺癌及前列腺慢性炎症组织、胃癌、结肠癌、甲状腺乳头状癌等肿瘤组织中高表达;在肺肿瘤组织中,SPATA12主要表达于非小细胞肺癌,其中在腺癌、鳞癌、类癌和大细胞癌组织的阳性表达率分别为16.13%,29.17%,30%和100%.SPATA12的阳性表达率与肺癌不同病理类型相关(P<0.01),而与年龄、性别以及临床分级无关(P>0.05).SPATA12基因具有肿瘤-睾丸抗原的组织表达谱特点,其阳性表达与肺肿瘤组织的不同病理类型存在明显的相关性,对肺肿瘤的分子分型有一定的参考价值.

小鼠生精细胞发育特异基因spata3的表达分析和克隆纯化

背景:雄性哺乳动物生精细胞自发性或诱发性凋亡现象与细胞凋亡相关基因有着密切的联系。spata3是一个新发现的小鼠生精细胞凋亡相关基因。目的:探讨小鼠生精细胞发育特异基因spata3的表达特性,制备高纯度的可溶性GST-SPATA3融合蛋白。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-10/2008-08在山西医科大学生物化学与分子生物学实验室和组织学与胚胎学实验室完成。材料:pMD19-T Simple克隆载体及大肠杆菌菌株E.coli DH5α(TaKaRa公司),表达载体pET-41a(+)plasmid DNA(Novagen公司),大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)(Solarbio公司);1,2,3,5,8周龄雄性和8周龄雌性BALB/c小鼠。方法:麻醉后颈椎脱臼处死小鼠,取出各小鼠的睾丸组织和8周龄小鼠的大脑、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、卵巢、子宫,提取各组织总RNA。通过聚合酶链反应、定量聚合酶链反应和原位杂交研究spata3mRNA表达及定位;通过构建原核表达载体,诱导并纯化蛋白,制备抗体。主要观察指标:①反转录-聚合酶链反应分析spata3组织特异性表达。②荧光定量聚合酶链反应分析spata3的阶段特异性表达。③spata3mRNA细胞定位的杂交信号。④SPATA3重组蛋白在原核细胞的表达及其纯化。⑤重组蛋白的Western blot分析。结果:反转录-聚合酶链反应表明spata3具有显著的睾丸组织特异性表达特征;实时定量聚合酶链反应显示spata3在精子发生后期高表达,可能与精子细胞的变态成形过程密切相关;原位杂交证明spata3转录本主要定位在圆形和长形精子细胞内,进一步提示该基因参与了精子细胞发育后期的形态变化。DNA序列测定和SDS-PAGE分析证明spata3原核表达载体构建成功并可被高效诱导表达;Western blot印迹杂交显示纯化的SPATA3重组蛋白具有高度的特异性。结论:spata3是小鼠睾丸组织特异表达的精子发生相关基因,在圆形和长形精子细胞中处于高水平转录状态;实验获得的高纯度可溶性融合蛋白完全满足后期抗体制备的需要。

长链非编码RNA SPATA31D5P吸附微小RNA-320a促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的乳腺癌(BC)中存在多种长链非编码RNA(lncRNA)的异常表达,并且与生存预后密切相关。本研究旨在探讨lncRNA SPATA31D5P在乳腺癌中的表达并通过吸附miR-320a影响乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。方法收集乳腺癌组织及癌旁组织各30例,采用Real-time PCR检测SPATA31D5P在乳腺癌组织及乳腺癌细胞系中的表达水平。选择乳腺癌MDA-MB-231细胞转染针对SPATA31D5P siRNA干扰载体,采用CCK-8法、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)法、Transwell小室实验和细胞划痕实验测定细胞增殖、侵袭和迁移能力,流式细胞术检测细胞周期和凋亡的改变。采用生物信息学方法筛选可与SPATA31D5P互补结合的miRNAs,Real-time PCR及双荧光素酶报告实验验证SPATA31D5P对miR-320a的调控作用。结果乳腺癌组织中SPATA31D5P水平显著高于邻近正常乳腺组织,各乳腺癌细胞系中SPATA31D5P表达都高于正常乳腺上皮细胞MCF10 A。siRNA干扰组的SPATA31D5P水平为0.288±0.052,低于空白对照组的1.114±0.096和阴性对照(NC)组的1.079±0.128(P<0.01)。与NC组和空白对照组相比,干扰组MDA-MB-231细胞的增殖活力明显下降并出现G_(1)期阻滞,凋亡率明显增加(P<0.01);干扰组的划痕愈合率和穿膜细胞数目分别为(14.36±1.75)%和(26±1.52)个,低于NC组的(52.25±1.87)%和(67.33±2.91)个(P<0.01)。双荧光素酶实验证实,SPATA31D5P能够直接调控miR-320a的表达及荧光素酶活性。结论 SPATA31D5P在乳腺癌中高表达,干扰其表达能有效抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与靶向调控miR-320a有关。

小鼠Spata3蛋白结构和功能的生信分析及初鉴

目的对小鼠精子发生相关蛋白3(spermatogenesis associated protein 3,Spata3)的序列进行分析,探讨其结构和功能。方法利用NCBI数据库比对小鼠Spata3的同源性、ExPASy ProtParam软件分析理化特征、SOPMA及GOR4预测空间构象、NetPhos3.1及STRING数据库分析蛋白修饰位点及蛋白间相互作用关系等信息、免疫组化和免疫荧光染色检测其组织细胞定位。结果小鼠和人的Spata3基因CDS序列64%相同,是碱性不稳定亲水蛋白,无信号肽,属于非跨膜的胞内蛋白,主要定位于睾丸组织各级精子细胞核和胞质,以圆形精子细胞表达量最高。小鼠Spata3含1个内在无序区结构域,30个潜在的磷酸化位点,11个潜在的O-型糖基化位点,可能与Spata46、Spert等蛋白相互作用。结论小鼠Spata3是精子发生过程中的保守蛋白,可能调节精子发生变形过程。

可诱导的稳定表达Spata3细胞系的建立及特征(英文)

spata3是一个在睾丸中特异性表达的基因,可能与精子发生或生精细胞凋亡相关。为了进一步研究Spata3的功能,将spata3克隆入经修饰的pcDNA5/FRT/TO表达载体,应用Flp-InTMT-RExTM-293细胞系作为宿主细胞,成功地构建了可被四环素或Doxycline诱导的稳定表达Flp-InTMT-RExTM-sptat3的细胞系。该细胞系在spata3基因的3'端有2×FLAGtag和2×Histag,在缺乏可利用的spata3或其抗体的情况下,也能够很容易地应用商品化的FLAG抗体检测到spata3全长蛋白的表达。这种可诱导的稳定表达Flp-InTMT-RExTM-spata3的细胞系的建立,不仅有利于spata3的分析鉴定和功能研究,而且对于其他蛋白质的分离纯化和功能研究也有很好的借鉴作用。

团头鲂SPATA4基因的分子克隆及表达分析

采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术从团头鲂精巢中克隆出精子发生相关基因4(sper-matogenesis associated gene 4,SPATA4)。该基因cDNA全长为1 076 bp,包括1个678 bp的完整阅读框架,编码225个氨基酸,预测的氨基酸序列的分子质量为25.72 ku,等电点为9.32。序列分析显示团头鲂SPATA4基因与其他脊椎动物同源性较高。荧光定量PCR结果显示SPATA4基因在受精后1～206 h期间,该基因在受精后4 h和受精后28 h的表达量最高,在受精后50 h表达量最低,而在其他时期的表达水平基本一致;在所检测的10个组织中,SPATA4基因在精巢中的表达量最高。

电离辐射和紫杉醇诱导的KB细胞中SPATA5L1和Cyclin B2表达的变化

电离辐射与紫杉醇协同作用,可以诱导体外培养的人口腔上皮癌KB细胞出现G2/M阻滞,形成多核细胞,并最终造成死亡。先前通过基因芯片筛选研究发现,在经过电离辐射和/或紫杉醇作用后,有10条与细胞分裂有关的基因存在差异表达。本研究旨在通过Real-time PCR和Western Blot定量分析其中两条基因SPATA5L1和CyclinB2的表达变化,来揭示G2/M阻滞及多核细胞形成的分子机制。结果表明,在受到6 Gy以下不同剂量的电离辐射或电离辐射与40 nmol/L紫杉醇协同作用后,SPATA5L1的表达量明显增加,但同时Cyclin B2的表达量则下降。推测SPATA5L1上调表达和CyclinB2适度的下调表达,使受处理细胞在胞核分裂后阻止胞浆分裂而无法形成正常子代细胞,导致G2/M阻滞及多核细胞形成。

SPATA22基因多态性与中国汉族非梗阻性无精子症的易感性关联分析

目的探讨精子发生相关基因22(SPATA22)基因的7个标签单核苷酸多态性(SNP)位点多态性与中国汉族非梗阻性无精子症(NOA)的易感性的相关性。方法选取368例已生育的男性(对照组)和361例NOA患者(病例组),应用Sequenom Mass Array质谱阵列技术检测对照组和病例组SPATA22基因7个标签SNPs的基因型。应用Plink1.07软件及Haploview软件对数据资料进行统计分析,比较对照组与病例组SPATA22基因的最小等位基因频率(MAF)基因型及单体型的差异。结果 SPATA22基因7个标签SNPs的MAF、基因型及单体型在对照组与病例组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 SPATA22基因7个标签SNPs位点多态性与中国汉族男性NOA的易感性可能不相关。

弓形虫微线体蛋白6,7,8与宿主Spata3,Dkk2蛋白相互作用的研究

为了研究弓形虫微线体蛋白6(MIC6)、7(MIC7)及8(MIC8)是否与宿主精子生成相关蛋白3(Spata3)和Dickkopf相关蛋白2(Dkk2)互作,首先从弓形虫RH虫株cDNA中扩增了弓形虫MIC6、MIC7及MIC8基因,并从小鼠cDNA中扩增了Spata3和Dkk2基因。然后分别构建pGADT7-MIC6、pGADT7-MIC7和pGADT7-MIC8捕获载体及pGBKT7-Spata3和pGBKT-Dkk2诱饵载体。利用Clon Tech公司的MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid系统,将诱饵载体分别转化Y2HGold酵母菌,将捕获载体分别转化Y187酵母菌,最后通过酵母点对点验证分析弓形虫MIC6、MIC7和MIC8蛋白是否与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作。结果表明:在酵母双杂交系统里MIC7和MIC8蛋白分别能够与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作,而MIC6不能够与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作。

长链非编码RNA SPATA3-AS1在胃癌中的表达及意义

目的:研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)SPATA3-AS1在胃癌患者癌组织和血浆中的表达及临床意义,并进一步探讨其对胃癌细胞株的影响及其潜在机制。方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测80例胃癌及癌旁组织、29例胃癌患者和29例健康者血浆中SPATA3-AS1的表达水平;对胃癌患者SPATA3-AS1表达与其临床病理特征行统计学分析。敲减SPATA3-AS1,分别转染胃癌AGS、HGC-27细胞,采用细胞增殖、克隆形成、Transwell实验及流式细胞术分别检测细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡;采用qRT-PCR检测肿瘤相关基因mRNA的表达水平。结果:SPATA3-AS1在胃癌组织中呈高表达,其表达与淋巴结转移、肿瘤TNM分期、肿瘤浸润深度及肿瘤预后相关;胃癌患者血浆中SPATA3-AS1也呈高表达,其表达与淋巴结转移、肿瘤直径、肿瘤TNM分期呈正相关。血浆中SPATA3-AS1表达水平诊断胃癌ROC曲线下面积为0.788。敲减SPATA3-AS1后,胃癌AGS、HGC-27细胞增殖及移动活力减弱,细胞凋亡能力增强。同时N-钙黏蛋白、Twist1、Snail mRNA表达下调而E-钙黏蛋白mRNA表达上调。结论:SPATA3-AS1在胃癌患者癌组织及血浆中呈高表达并与其预后相关;敲减SPATA3-AS1后胃癌细胞增殖、迁移及侵袭等能力均受到抑制,细胞凋亡增强,可能与对上皮间质转化过程的调控有关。

SPATA3基因克隆及其在牦牛和犏牛睾丸中的差异表达研究

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3(spermatogenesis associated 3,SPATA3)基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨SPATA3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提供理论依据。本试验以牦牛为研究对象,利用RT-PCR克隆技术获取牦牛SPATA3 cDNA序列,使用生物信息软件分析其结构和功能,并检测其在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达谱。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测SPATA3基因在牦牛和犏牛睾丸不同发育时期的表达规律;采用免疫组化技术检测SPATA3在牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达差异。结果显示,SPATA3基因CDS区为693 bp,编码230个氨基酸,与黄牛、野牦牛和水牛的同源性较高;SPATA3仅在耗牛睾丸组织中特异性表达,其它组织未见其表达。RT-qPCR结果显示,SPATA3基因在牦牛睾丸发育过程中均有表达,其中成年期(4~5岁)睾丸中的表达极显著高于胎牛时期(5~6月,P<0.01),且其在牦牛不同发育时期睾丸中的表达均极显著高于犏牛(P<0.01)。免疫组化结果发现,SPATA3在圆形精子、长形精子细胞胞浆中均表达,且成年期牦牛睾丸中该基因的表达水平极显著高于犏牛(P<0.01)。综上表明,SPATA3在遗传进化中高度保守,且在牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达,该基因低表达可能引起精子形成障碍,从而参与精子成熟进程,但具体功能有待进一步的研究。

猪SPATA6基因的多态性与精液品质性状的关联分析

公猪精液品质直接影响到猪场经济效益,通过转录组测序发现SPATA6基因在猪性成熟前后的睾丸组织中差异表达,并发现其内含子区域内存在多个SNP位点。通过SNaPshot的方法分别对杜洛克猪和大白猪中SPATA6基因的rs331255092和rs341061477位点进行分型,并与精液品质性状进行关联分析。结果表明,在杜洛克猪和大白猪中rs331255092和rs341061477位点均与精子畸形率显著相关,此外,在大白猪中rs331255092和rs341061477位点也与精液量显著相关。猪SPATA6基因的rs331255092和rs341061477位点对猪的精液品质存在潜在调控作用。

精子发生相关基因SPATA48在人和小鼠睾丸组织中的表达研究

目的通过分析精子发生相关基因SPATA48在人和小鼠睾丸组织中的表达,探讨SPATA48在精子发生中的作用。方法收集2010年1月至2017年12月在深圳市第二人民医院就诊的非梗阻性无精子症患者和正常生育者睾丸活检样本各60例;腹腔注射白消安方法建立小鼠无精子症模型,小鼠在不同时期处死后解剖留取各个脏器;提取小鼠各脏器组织、两组睾丸组织以及人精母细胞、精原细胞和支持细胞中mRNA;并购买人肺、肾、肝脏、脾脏等组织mRNA样本。利用RT-PCR方法检测SPATA48基因在各种细胞和组织器官、两组人睾丸组织中的表达水平,并利用免疫组化方法检测SPATA48蛋白在各种细胞和两组人睾丸组织中的表达水平,对各检测指标进行相关统计分析。结果 RT-PCR结果表明SPATA48基因特异表达在睾丸组织中,肺、肾脏、肝脏、脾脏等其他组织中均不表达;非梗阻性无精子症患者睾丸组织中无SPATA48基因表达,三种睾丸细胞仅精母细胞存在阳性表达。无精子症模型小鼠,随白消安处理时间的延长,SPATA48基因表达显著减弱(P<0.05)。免疫组化结果显示,在正常生育者睾丸中SPATA48蛋白主要表达在精母细胞和圆形精子细胞中,在非梗阻性无精子症患者睾丸中无SPATA48蛋白表达。结论 SPATA48特异表达在人和小鼠睾丸组织中,无精子发生的睾丸组织无表达,提示SPATA48基因在精子发生中具有重要作用。

小鼠睾丸凋亡基因MSRG-11的人类同源基因SPATA17的克隆(英文)

利用生物信息学方法结合实验手段克隆了一个在睾丸组织中特异高表达的小鼠生精细胞凋亡相关基因Spata17的人类同源基因SPATA17(GenBank登录号为AY963797)。应用生物信息学分析显示该基因定位在染色体1 q41,包含11个外显子,内含子和外显子交界区均符合gt-ag规则;该基因开放阅读框为1083 bp编码一个由361个氨基酸组成的、分子量为43.49 kD、等电点为9.71、含有三个保守IQ功能域的蛋白;对SPATA17编码蛋白质进行生物信息学分析,无跨膜区,无信号肽序列,推测为一非分泌性蛋白。多组织和Northern b lot结果显示该基因只在睾丸组织中特异高表达,转录本大小为2.0 kb。总之,研究表明SPATA17在睾丸组织生精细胞凋亡起重要作用。

SPATA5L1真核表达载体的构建及其对KB细胞增殖和迁移的影响

目的通过构建过表达质粒并筛选稳定细胞株，研究SPATA5L1基因对KB细胞增殖和迁移的影响。方法PCR扩增SPATA5L1基因全长，用载体pEX．1构建重组质粒，测序成功后转染人口腔癌KB细胞，并设空载体作对照，经过G418压力筛选后获得单克隆细胞株，Real．timePCR、Westernblot验证SPATA5L1基因的表达，光镜观察SPATA5L1对KB细胞形态的影响，CCK．8法检测细胞增殖情况，划痕实验观察细胞迁移能力。结果测序结果显示质粒构建成功，经过G418压力筛选所得到的稳定表达细胞株，在转录水平和蛋白水平均检测到目的基因的高表达，且细胞由正常状态下的多边形变为梭形，细胞增殖能力和体外迁移能力明显提高（P〈0．05）。结论成功构建pEX-1-SPATA5L1表达载体并获得稳定细胞株，过表达SPATA5L1蛋白能使KB细胞形态变长，增殖和迁移加快。

小鼠视网膜内Spata7基因敲除模型构建及其光感受器细胞凋亡机制的研究

目的构建小鼠Spata7基因视网膜内敲除模型,探讨Spata7基因突变导致光感受器细胞凋亡的机制。方法以腺相关病毒(AAV)为载体搭载CRISPR/Cas9系统,注射1μL AAV病毒混合液(3×1013 vg/mL)于出生14 d小鼠视网膜中,对Spata7基因进行视网膜内特异性敲除。1个月后行视网膜眼底照相观察AAV感染效率;定量PCR测定敲除效率;视觉电生理检测光感受器细胞功能;免疫荧光实验探究Spata7基因功能。结果AAV有效搭载CRISPR/Cas9系统进入视网膜内并对Spata7基因进行敲除,敲除效率为54%。小鼠光感受器细胞大量死亡,导致整体光感受器细胞功能明显下降。敲除后,视紫红质无法被转运到光感受器细胞外节,引起明显的内质网应激。结论Spata7基因敲除导致视紫红质蛋白运输到外节受阻而停留在内质网,并造成内质网应激,是导致光感受器细胞大量死亡的重要原因。

SPATA 48基因的多态性与男性少精症的相关性研究

目的:研究SPATA 48基因SNP rs12672941和SNP rs998928的多态性与男性少精症的相关性。方法:应用Snapshot基因分型技术,在279例少精症患者和234例正常男性中,对SNP rs12672941和SNP rs998928的多态性分布进行调查。结果:少精症患者中rs12672941的等位基因C(28.5%vs.22.8%,P=0.040,OR=1.344,95%CI为1.013~1.785)和含有C等位基因的患者(TC/CC)基因型频率(49.8%vs.40.6%,P=0.037,OR=1.453,95%CI为1.023~2.063)显著高于正常男性,而少精症患者TT基因型频率(50.1%vs.59.4%,P=0.037,OR=0.688,95%CI为0.485~0.978)显著低于正常男性。在少精症患者和正常男性之间,rs998928的等位基因频率和基因型频率分布无显著性差异(P>0.05)。结论:SPATA 48基因SNP rs12672941的多态性与少精症相关,影响男性少精症的发病风险。

精子发生相关基因SPATA功能的研究进展

SPATA基因是一类与精子发生相关的基因.精子发生依赖于一系列相关基因的正常表达与调控,SPATA基因在这个过程中起着一定的作用.本文通过参考大量SPATA基因相关文献,从SPATA基因在细胞增殖、细胞凋亡中的作用以及SPATA基因对多种相关疾病产生的影响和发病机理等多个方面,综述了精子发生过程中该类基因功能的研究进展,对于今后研究精子发生过程中有关特异基因的表达和细胞增殖、凋亡机理提供新思路;为研究精子发生的调控机制提供参考途径和方法;对于了解精子发生过程中产生的各种相关疾病的病因具有重要指导意义.

圆头精子症患者的遗传学检测与成功辅助育孕

【目的】分析圆头精子症患者的遗传学发病机制。【方法】回顾分析1例圆头精子症患者,对其进行多种遗传学方法的检测,包括染色体检查、Y染色体微缺失基因检测及通过array-CGH芯片技术和Sanger测序筛查候选基因DPY19L2、PICK1、SPATA16。【结果】该患者在我中心行两个卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)周期后,其妻孕足月剖宫产一对异卵双胞胎女儿。患者染色体核型为46,XY、Y染色体微缺失基因检测未见异常,array-CGH芯片检测排除了DPY19L2、SPATA16和PICK1基因及其他该芯片所涵盖区域的100kb以上的片段重复或缺失。Sanger测序PICK1、SPATA16基因也未发现点突变和小片段插入缺失等病理性改变。【结论】圆头精子症患者可通过ICSI方式获得健康后代,本研究排除了已知的候选基因DPY19L2、PICK1、SPATA16与该圆头精子症患者的致病相关,可能存在其他致病基因。

男性不育及遗传因素研究进展

不育症是一个严重的社会问题,其中男性因素所致的不育约占到所有不育症的一半。我们计划在近期的文献的背景下探讨在人类精子发生过程中起着重要的作用的在Y染色体或者常染色体上的基因。检索以下关键词:男性不育基因,精子发生的遗传学来获得本文所需信息。结果利用基因敲除小鼠模型阐明的生精功能机制已经取得了显著的进展,但是该信息并未直接应用于人。然而,已经证实几个重要基因的突变可以引起不育。本文中将讨论Y染色体中无精子症区域(AZF)的一些确定可导致不育的基因,和常染色体上的SYKP3,KLHL10,AURKC和SPATA16基因。阐明男性不育的潜在基因,可以帮助我们更好理解不育的起因,从而帮助我们更好地为患者量身定制治疗策略。