H9N2 AIV灭活疫苗免疫SPF鸡攻毒后肺组织免疫相关基因表达变化研究

[目的]本试验旨在探究H9N2亚型禽流感病毒攻击对H9灭活疫苗免疫SPF鸡呼吸系统的影响。[方法]选用36只3周龄SPF鸡,随机分为对照组(Con)、攻毒组(Flu)、免疫后攻毒组(Vac+Flu)。以每只0.4 mL剂量免疫接种H9灭活疫苗,3周后以10~6 EID_(50)的病毒量进行攻毒,采集拭子、血清、气管、肺组织等样品,通过血凝抑制(HI)试验、RT-PCR、荧光定量PCR(qPCR)等方法检测血清中HI抗体滴度、肺脏流感病毒M基因拷贝数以及免疫相关基因CD4、CD8、GATA3、T-bet、IL-4、IL-13、TNF-α、IFN-γ、Perforin、Granzyme、FasL、Fas等的表达量;并利用HE染色、免疫组织化学的方法观察气管、肺脏的病理变化及病毒特异性抗原NP蛋白的分布特征。[结果]HI试验结果显示,SPF鸡疫苗免疫后可产生较高的H9N2 AIV抗体效价。免疫保护试验和RT-PCR结果显示,SPF鸡疫苗免疫后攻毒仍能检测到机体排毒和流感病毒M基因在肺脏组织中的表达。HE染色和免疫组化结果显示,接种H9N2 AIV灭活疫苗后能够明显减轻SPF鸡气管和肺脏的病理损伤,降低气管、肺脏中的病毒载量。荧光定量PCR结果显示,接种H9N2 AIV灭活疫苗后能够提高SPF鸡肺脏中Th1、Th2细胞因子分泌水平,促进穿孔素/颗粒酶途径相关基因表达进而增强肺脏中细胞毒性反应。[结论]H9N2疫苗免疫鸡感染H9病毒后虽然仍存在排毒现象,但其抗病毒免疫系统活跃、其主要器官病毒载量降低,建议按照流感疫苗免疫程序进行免疫接种,提高对流感的防控水平。

一株鸡传染性贫血病毒对不同日龄SPF鸡的致病性研究

为评价鸡传染性贫血病毒AV1550株的致病性,取1日龄、7日龄和14日龄SPF鸡分别经胸部肌肉注射不同病毒含量的病毒液,同时设置正常对照,隔离饲养观察21 d。感染后14 d采血测定红细胞压积,21 d统计死亡率、体重变化以及胸腺、骨髓、法氏囊病变情况并测定1日龄SPF鸡感染后不同组织中的病毒载量。结果表明,1日龄SPF鸡感染AV1550株后,表现出精神沉郁、增重减缓、贫血等明显的临床症状,死亡率为53.9%;死亡鸡或观察期结束时存活鸡剖检,可见胸腺萎缩,骨髓变成淡黄色;不同剂量感染后14 d,均能引起红细胞压积显著下降;21 d时,胸腺病毒载量最高,可达10^(6.7) copies/mg。7日龄SPF鸡感染后,出现增重减缓,高感染剂量(100000EID_(50))出现贫血,部分鸡出现胸腺萎缩和骨髓病变,但病变率低于30%。14日龄SPF鸡感染后,不引起明显临床症状。研究证实,CAV对SPF鸡的致病性具有明显的日龄依赖性,红细胞压积降低、骨髓病变、胸腺萎缩以及胸腺病毒载量测定可作为评价CAV致病的指标。

不同毒力传染性支气管炎病毒诱导SPF鸡炎症反应的免疫机制

以specific pathogen-free(SPF)鸡为研究对象,通过滴鼻点眼方式感染传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)强毒株(CK/CH/LDL/140520)和IBV弱毒株(γCoV/ck/China/I0718/17)。分别在感染后12、36 h和3、7、14 d,采集法氏囊、脾脏、肾脏和气管,运用实时荧光定量PCR法,检测感染不同毒力IBV后,SPF鸡各脏器组织中免疫相关因子表达差异,初步探讨SPF鸡对不同毒力IBV免疫反应机制。结果表明,IBV弱毒株感染早期主要上调Toll样受体15(Toll-like receptors 15,TLR15)基因表达水平,提高白细胞介素(Interleukin,IL-1β)、IL-8基因表达量。法氏囊是介导启动获得性免疫反应的主要器官;脾脏是介导调控获得性免疫反应的主要器官,IBV强毒株在感染后期持续诱导提高TLR7、TLR15、TLR21基因和IL-6基因表达水平。可知,不同毒力IBV诱导SPF鸡炎症反应的免疫活化机制及介导调控获得性免疫反应的器官存在一定差异,为进一步揭示IBV强弱毒株致病性差异及诱导宿主不同免疫反应激活机理提供新的参考依据。

我国SPF鸡和SPF鸡胚的生产及应用现状

通过对7家SPF鸡场的实地调查和对全国28个兽医生物制品厂及7个中试车间的函调了解到,目前全国共有SPF鸡生产鸡舍22298m2,已投入生产的为16040m2,2000年全国7家SPF鸡场共生产SPF鸡胚534.6万枚,年最大生产能力为936.8万枚。如果制造禽用活疫苗全部使用SPF鸡胚,年需求量约为1500万枚,SPF鸡胚的供应需补缺564万枚。在2000年的疫苗检验中共应用SPF鸡28348只,其中在隔离器内饲养并进行检验的SPF鸡为14129只。SPF鸡的质量检测情况不容乐观,按国际通用的监测要求进行监测的只有3家。

SPF鸡与普通鸡消化道主要正常菌群数量的比较

采用微生态学方法,对SPF鸡和普通鸡嗉囔、腺胃、回肠、盲肠和直肠5个部位的梭杆菌、真杆菌、消化球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、类杆菌、肠球菌、葡萄球菌和肠杆菌等9种主要正常菌群进行定性、定量分析。结果表明,SPF鸡嗉囔中真杆菌、梭杆菌、双歧杆菌、类杆菌、葡萄球菌和肠杆菌数高于普通鸡,其中真杆菌、梭杆菌、葡萄球菌和肠杆菌数差异极显著(P<0.01);腺胃中梭杆菌、真杆菌、消化球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、类杆菌和肠杆菌数高于普通鸡,其中真杆菌数差异显著(P<0.05);回肠中真杆菌、双歧杆菌、类杆菌、葡萄球菌和肠杆菌数高于普通鸡,其中类杆菌数差异极显著(P<0.01);盲肠中梭杆菌、消化球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌和肠球菌数低于普通鸡,其中乳酸杆菌数差异显著(P<0.05);直肠中各菌数量都低于普通鸡,其中双歧杆菌和乳酸杆菌差异显著(P<0.05)。

共表达禽流感病毒HA和NA基因的重组禽痘病毒在SPF鸡的免疫效力试验

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的HA和NA2个基因同源重组到禽痘病毒基因组中,获得了能同时高效表达这2种蛋白的重组禽痘病毒(rFPV-HA-NA)。将rFPV-HA-NA经翅膀刺种途径接种8周龄SPF鸡,免疫后4周分别用10LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)和A/FPV/Rostock/34(H7N1)毒株进行攻击。结果重组禽痘病毒免疫鸡群诱导产生了高水平的抗体,能够完全抵抗H5N1和H7N1亚型病毒的致死性攻击;并可有效阻止病毒在泄殖腔的排出。而禽痘病毒免疫组和非免疫对照组在攻毒后全部发病并死亡。

IBDV超强毒株感染SPF鸡后法氏囊淋巴细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白动态表达的研究

为证实传染性法氏囊炎超强毒SNJ93株感染SPF鸡后1～14 d内法氏囊淋巴细胞中Bcl-2、Bax蛋白的动态表达与淋巴细胞凋亡的关系。应用透射电镜观察、TUNEL法标记检测凋亡的淋巴细胞,用免疫组织化学方法检测Bcl-2、Bax蛋白。结果表明,感染后1～7 d可见到大量凋亡的淋巴细胞,其中感染后3～5 d最多。感染后1～9d Bcl-2蛋白显著高于同时点的对照组(P<0.01);感染后1～5 d Bax蛋白明显高于同时点的对照组,差异极显著(P<0.01);感染后第7天高于同时点的对照组,差异显著(P<0.05); Bcl-2/Bax比率在感染后第1天低于同时点的对照组(P<0.05);3～5 d明显低于同时点的对照组(P<0.01)。SNJ93感染SPF雏鸡后1～7 d内法氏囊淋巴细胞会发生大量凋亡,Bcl-2/Bax能准确反映淋巴细胞的凋亡程度。

SPF鸡人工感染禽源大肠杆菌、H9亚型禽流感病毒后的体液免疫应答和死亡率分析

SPF鸡经不同顺序、不同时间间隔人工感染MPAIV和E.coli173株(O4)后,对试验鸡的病死率和针对大肠杆菌不同抗原体液免疫应答水平等进行研究。结果表明:各混合感染组试验鸡病死率明显高于单独接种组,且以先接种MPAIV再接种E.coli组死亡率最高;各混合感染组试验鸡针对E.coliOMPs和LPS的抗体水平低于单独感染E.coli组,其中又以先接种MPAIV再接种E.coli组为最低,提示MPAIV和E.coli间存在协同致病作用,这种协同机理可能与因MPAIV的感染导致一定程度的免疫抑制并进而促进了E.coli在体内的定居与繁殖有关。

三型副鸡禽杆菌对SPF鸡的致病力试验

为探讨3株A型C-Hpg 8(CVCC254)、B型(BJ-05株)和C型(668)副鸡禽杆菌对SPF鸡的致病力,用120只57日龄SPF鸡进行了此3个菌株的致病力试验,分别眶下窦内接种1.5×104cfu/0.2 mL.只-1～400×104cfu/(0.2 mL/只-1)C-Hpg 8、BJ-05株和668株,每个剂量攻击5只鸡,攻毒后观察7 d,结果除1只鸡未发病外,119只鸡均呈现典型的鸡传染性鼻炎症状。结果表明,C-Hpg 8、BJ-05株和668株副鸡禽杆菌对SPF鸡均有很强的致病力。

重组鸡白细胞介素18(rChIL-18)对MDV感染SPF鸡细胞免疫的影响

用马立克氏病病毒(MDV)感染5日龄SPF鸡后,取21日龄和35日龄鸡的淋巴细胞,运用3H-TdR掺入法检测T淋巴细胞对ConA和重组鸡白细胞介素18(rChIL-18)的反应,并用MTT法检测NK细胞和CTL对MD肿瘤细胞系CU147的杀伤活性及rChIL-18和IFN-γ对它们的作用。结果显示,SPF鸡感染MDV后淋转水平显著下降,NK细胞、CTL杀伤活性在感染后21日龄时升高,而在35日龄时NK细胞杀伤活性显著下降。rChIL-18对对照组和感染组SPF鸡的淋转水平和杀伤活性均有提高作用,同样IFN-γ也具有提高NK细胞和CTL杀伤活性的作用。

对中国SPF鸡微生物监测的建议

SPF意为无特定病原,SPF鸡和SPF种蛋在人禽生物制品、禽病研究和病毒学研究等方面应用广泛。我国是一个利用SPF鸡和SPF种蛋的大国。借鉴国外经验,制订切合国情的SPF鸡微生物监测标准,健全行业法律法规对我国SPF鸡的发展将有重要意义,从而也推动整个养禽业的健康发展。

鸭呼肠孤病毒人工感染SPF鸡胚的病理学研究

【目的】前人研究表明禽呼肠孤病毒可以经卵垂直传播,禽呼肠孤病毒能引起雏禽的病毒性关节炎、呼吸道和肠道疾病、肝炎、心肌炎、免疫抑制等。以实验室分离的鸭呼肠孤病毒HP080421株为研究对象,该毒株引起病变主要以鸭软脚为主要临床特征,病鸭肝脏和脾脏表面有大量的白色坏死灶、肾脏肿大、出血为主要病变特点。鸭呼肠孤病毒对鸡胚的致病性研究,旨在通过雏鸡的病理变化特点,探讨所分离的HP080421鸭呼肠孤病毒株是否也可感染鸡群,为鸡场鸭呼肠孤病毒感染的防控提供理论依据。【方法】运用华中农业大学兽医病理学实验室分离鉴定的HP080421株鸭呼肠孤病毒通过尿囊腔接种SPF鸡胚,建立SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型,培养鸡胚至雏鸡出壳,运用临床观察、病理剖检、H.E染色和免疫组织化学染色等病理组织学检查方法,对鸭呼肠孤病毒感染SPF鸡胚进行病理学研究和致病性分析。【结果】研究发现病毒感染鸡胚孵化培养至22—23日龄均啄壳,但不能自主出壳,需人工剥壳。病理剖检可见雏鸡的肝脏、脾脏肿胀质脆,表面及实质分布有黄白色坏死灶;脑部组织肿胀,并可见出血点和出血斑。H.E染色的组织病理学观察可见接毒组雏鸡肝脏、脾脏的坏死灶周围有大量淋巴细胞浸润;法氏囊的滤泡髓质部和胸腺的髓质部淋巴细胞减少、缺失;脑、肺脏、肾脏存在不同程度的淤血、出血和水肿;免疫组织化学染色结果表明:病毒阳性信号主要分布于肝脏、脾脏、肺脏和法氏囊等器官,并且位于上皮细胞和巨噬细胞的细胞质和胞核内。【结论】鸭呼肠孤病毒株HP080421能够在SPF鸡胚中复制增殖,并使雏鸡主要器官发生明显的病理变化,病理变化主要集中在肝脏和淋巴器官,因此鸭呼肠孤病毒可通过垂直传播感染鸡群,还可导致雏鸡免疫抑制。本研究通过SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型,阐述了鸭呼肠孤病毒感染鸡群的可能性,因此在实际养殖过程中,养殖户要防止鸭呼肠孤病毒对鸡胚的污染,切断传播途径,以达到预防鸡群感染鸭呼肠孤病毒的目的。

禽网状内皮组织增生病病毒和呼肠孤病毒感染SPF鸡对IFN-γ产生的影响

1日龄SPF鸡分别接种禽网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽呼肠孤病毒(ARV)和REV+ARV,于感染后3、5、46 d采集脾细胞做脾淋巴细胞培养并采用双抗体夹心ELISA法检测IFN-γ水平。结果表明,与对照相比,鸡感染REV后脾淋巴细胞IFN-γ的分泌水平显著升高。感染后5 d,REV单独感染引起IFN-γ8倍的增长,达到峰值,然后逐渐下降。ARV单独感染引起IFN-γ2倍的增长。REV和ARV共感染鸡脾淋巴细胞IFN-γ的分泌量增长了3倍。至感染后46 d,共感染和REV单独感染的IFN-γ水平与对照组相比仍然差异显著,ARV单独感染与对照组相比差异不再显著。

2007年～2010年H9N2亚型禽流感病毒分离株对SPF鸡的致病特性研究

本研究对2007年～2010年我国H9N2亚型禽流感病毒分离株的鸡胚平均死亡时间(MDT)进行分析,发现自2008年下半年来分离的H9N2亚型禽流感病毒对鸡胚的致病性有增强的趋势,在此基础上,选择MDT在60.5～96.3h之间的9株病毒,比较其对SPF鸡的致病力。结果表明,对鸡胚致病性强的毒株,对SPF鸡的致病性也较强,能引起气管、肺、十二指肠、肾和脑等多器官的系统性感染,而且病毒在各组织器官的复制能力与致病性呈正相关。在感染SPF鸡后,所有毒株均呈现不同程度的排毒,而致病力较强毒株的感染组,排毒的比例更高,排毒时间也更长。这些数据表明,H9N2病毒在进化过程中,致病力发生了一定的变化,新近出现了一些对鸡致病力增强的毒株,这提示我们必须重视对H9N2病毒进化和变异的监测,加强对H9N2病毒的防控。

应用微卫星DNA标记对BWEL-SPF鸡种群的群体遗传学分析

本研究利用14个鸡微卫星DNA标记位点,采用DNA测序仪和荧光素标记分子内标,建立了鸡分子遗传学的检测方法,对F15世代BWEL-SPF鸡种群8个家系群体内和群体间的遗传结构进行了分析。结果表明,被检位点35.7%(5/14)的基因型趋于纯合,家系内等位基因的变异程度显著降低。F-统计量检验结果表明,家系间的遗传分化均达到了极显著水平(P<0.001),群体间的变异占到了总遗传变异的12.9%。

3株H3N8亚型禽流感病毒对SPF鸡和Balb/c小鼠致病性研究

为了解从洞庭湖区鸭子和环境中分离的3株H3N8亚型禽流感病毒的致病性。利用这3株毒株对SPF鸡及Balb／c小鼠进行致病性试验，结果显示，3株毒株均能使鸡感染并排毒，但不引起鸡明显的临床症状及死亡，感染鸡后第3天～第7天在泄殖腔排出高滴度病毒，且持续至第11天（仅观察到该天），与以往的研究相比，排毒时间更长。3株H3N8亚型毒株感染小鼠后，能在小鼠鼻甲及肺脏内高滴度复制，但小鼠的体重变化不明显。结果说明3株H3亚型AIV对家禽及哺乳动物感染能力增强，因此加强该亚型的流行病学监测及致病性的研究非常重要。

IBDV强毒株与弱毒株对SPF鸡侵染过程的研究

用DIG标记PS19探针和异硫氰酸荧光素标记的鸡抗IBDVIgG,对人工接种IBDV强毒株Hrb和弱毒细胞适应株Ts后不同时间段的法氏囊、盲肠扁桃体、脾、肾、肝、胸腺、大腿及胸部肌肉的石蜡切片分别进行原位杂交和荧光抗体检测。同时将各时间段每种组织的石蜡切片进行HE染色以观察组织破坏情况。结果发现,用原位杂交和荧光抗体两种方法首先分别于接种Hrb后8h和16h在法氏囊中检测到IBDV的阳性信号,然后依次是盲肠扁桃体、脾、肾、肝、胸腺。侵害程度以法氏囊最重。实验结果表明:Hrb毒株在组织中复制速度快,并迅速在SPF鸡体内传播。Ts毒株侵染较轻,对器官组织无损伤。

几种消毒方法对SPF鸡培育室消毒效果评价

通过应用几种消毒剂和消毒方法，对ＳＰＦ鸡培育室进行消毒，测定不同消毒剂和方法消毒后微生物消长情况，比较不同消毒剂和方法的消毒效果。认为１０％过氧乙酸喷雾和１０．６１ｇ／ｍ３甲醛（硅油）熏蒸消毒是比较理想的消毒方法。

纳米氧化铜对SPF鸡组织中铜和锌沉积的影响

高原等报道,高铜日粮能显著降低血清中锌的含量。闫素梅等报道,日粮中锌的缺乏或过量会引起铁与铜代谢的紊乱。纳米氧化铜在肠道是以离子还是粒子形式吸收,尚需研究证明。通过比较研究纳米氧化铜、硫酸铜和氧化铜对SPF鸡脏器组织铜和锌沉积的影响,探讨纳米氧化铜在动物体内的吸收代谢机制。