鸭呼肠孤病毒人工感染SPF鸡胚的病理学研究

【目的】前人研究表明禽呼肠孤病毒可以经卵垂直传播,禽呼肠孤病毒能引起雏禽的病毒性关节炎、呼吸道和肠道疾病、肝炎、心肌炎、免疫抑制等。以实验室分离的鸭呼肠孤病毒HP080421株为研究对象,该毒株引起病变主要以鸭软脚为主要临床特征,病鸭肝脏和脾脏表面有大量的白色坏死灶、肾脏肿大、出血为主要病变特点。鸭呼肠孤病毒对鸡胚的致病性研究,旨在通过雏鸡的病理变化特点,探讨所分离的HP080421鸭呼肠孤病毒株是否也可感染鸡群,为鸡场鸭呼肠孤病毒感染的防控提供理论依据。【方法】运用华中农业大学兽医病理学实验室分离鉴定的HP080421株鸭呼肠孤病毒通过尿囊腔接种SPF鸡胚,建立SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型,培养鸡胚至雏鸡出壳,运用临床观察、病理剖检、H.E染色和免疫组织化学染色等病理组织学检查方法,对鸭呼肠孤病毒感染SPF鸡胚进行病理学研究和致病性分析。【结果】研究发现病毒感染鸡胚孵化培养至22—23日龄均啄壳,但不能自主出壳,需人工剥壳。病理剖检可见雏鸡的肝脏、脾脏肿胀质脆,表面及实质分布有黄白色坏死灶;脑部组织肿胀,并可见出血点和出血斑。H.E染色的组织病理学观察可见接毒组雏鸡肝脏、脾脏的坏死灶周围有大量淋巴细胞浸润;法氏囊的滤泡髓质部和胸腺的髓质部淋巴细胞减少、缺失;脑、肺脏、肾脏存在不同程度的淤血、出血和水肿;免疫组织化学染色结果表明:病毒阳性信号主要分布于肝脏、脾脏、肺脏和法氏囊等器官,并且位于上皮细胞和巨噬细胞的细胞质和胞核内。【结论】鸭呼肠孤病毒株HP080421能够在SPF鸡胚中复制增殖,并使雏鸡主要器官发生明显的病理变化,病理变化主要集中在肝脏和淋巴器官,因此鸭呼肠孤病毒可通过垂直传播感染鸡群,还可导致雏鸡免疫抑制。本研究通过SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型,阐述了鸭呼肠孤病毒感染鸡群的可能性,因此在实际养殖过程中,养殖户要防止鸭呼肠孤病毒对鸡胚的污染,切断传播途径,以达到预防鸡群感染鸭呼肠孤病毒的目的。

SPF鸡胚及其发展现状

综述了SPF鸡胚在生物医学、畜牧兽医学研究和生物制品的生产、鉴定等领域的广泛应用,目前国内SPF鸡胚的生产能力和的质量状况,并对存在的问题提出了建议。

我国SPF鸡胚生产与质量控制现状分析

从生产能力、饲养方式、微生物质量监测等方面介绍了我国SPF鸡胚发展概况,对我国SPF鸡胚生产与质量控制现状进行了调查与分析,并对存在的问题提出建议。经调查,2012年我国有20家SPF鸡生产企业生产SPF鸡胚年产量约5050万枚,其中年产600万枚以上的企业有3家,300万～600万枚的企业有4家,10家企业年产量在100万～200万枚之间,其他3家企业年产量少于100万枚。从供需情况可以看出,目前我国SPF鸡胚生产数已供大于求略有结余。

我国SPF鸡和SPF鸡胚的生产及应用现状

通过对7家SPF鸡场的实地调查和对全国28个兽医生物制品厂及7个中试车间的函调了解到,目前全国共有SPF鸡生产鸡舍22298m2,已投入生产的为16040m2,2000年全国7家SPF鸡场共生产SPF鸡胚534.6万枚,年最大生产能力为936.8万枚。如果制造禽用活疫苗全部使用SPF鸡胚,年需求量约为1500万枚,SPF鸡胚的供应需补缺564万枚。在2000年的疫苗检验中共应用SPF鸡28348只,其中在隔离器内饲养并进行检验的SPF鸡为14129只。SPF鸡的质量检测情况不容乐观,按国际通用的监测要求进行监测的只有3家。

SPF鸡胚生产存在的问题与对策

1 存在问题 1．1 SPF鸡胚的供应量严重不足 2006年我国所有的禽用活疫苗及猪伪狂犬病活疫苗等全部使用SPF胚，至少需要2200万个，与1200多万个的供应能力，存在1000万个的缺口。由于SPF鸡胚的供应量严重不足，各兽用生物制品企业为完成生产任务。在紧急情况下很可能会使用非免疫胚或低免疫胚代替SPF鸡胚。这样就会严重的影响到疫苗的质量，影响我国疫病防控的效果，最后危害的是我国养禽业的健康发展。

不同病毒在SPF鸡胚与普通鸡胚繁殖性能的比较

利用HI和AGP方法检测普通种蛋中ND和IBD的卵黄抗体水平,利用HA和EID50检测方法比较多种病毒(如NDV、IBV、IBDV及AEV)在SPF鸡胚与普通鸡胚上繁殖性能的差异。研究结果表明:普通种蛋中ND及IBD的卵黄抗体水平普遍较高,在SPF鸡胚上新城疫LaSota病毒繁殖量是普通鸡胚的5～20倍,尿囊液血凝效价平均高2.0～2.5滴度。MA5毒株在SPF胚病毒液EID50为普通鸡胚的10倍以上熏且每次检测的结果比较接近。IBDV、AEV等病毒在普通鸡胚上几乎不能增殖。

5-氟脱氧尿核苷对SPF鸡胚最适浓度的测定及对禽痘病毒的抑制作用

用不同浓度的5-氟脱氧尿核苷(FUdR)接种10日龄SPF鸡胚,每个浓度分别接种5枚鸡胚,0.2 mL/枚,同时,设接种同剂量生理盐水的空白对照SPF鸡胚5枚,置37℃孵化培养。18日龄时全部打开鸡胚,观察鸡胚变化。将试验组鸡胚与对照组相比较,以接种鸡胚全部不出现任何异常变化的药物浓度确定为最适浓度。试验结果表明FUdR对10日龄鸡胚的最适浓度为250μg/mL,此浓度对禽痘病毒(属DNA病毒)的生长有明显的抑制作用。试验表明,以10日龄SPF鸡胚作为试验动物,可以用FUdR鉴定病毒的核酸类型。

绵羊肺炎支原体人工感染SPF鸡胚的研究

为探索SPF鸡胚作为绵羊肺炎支原体实验室感染模型的可行性,本试验用不同浓度绵羊肺炎支原体(10^8、10^9、10^10 ccu/mL)经由卵黄囊和尿囊腔两个部位接种7日龄SPF鸡胚,通过统计鸡胚死亡情况和不同鸡胚组织样品中绵羊肺炎支原体检测阳性率(PCR检测和支原体分离鉴定),确定绵羊肺炎支原体鸡胚感染方式、感染剂量和最佳分离部位,再用3株不同来源的绵羊肺炎支原体分离株感染鸡胚,观察其对鸡胚的致病力。结果表明,绵羊肺炎支原体感染鸡胚最佳接种途径为卵黄囊接种,感染剂量为10^9 ccu/mL、0.2 mL/只,最佳分离部位为卵黄液。3株支原体均能感染和致死鸡胚,并均能从卵黄液中分离到绵羊肺炎支原体,但对鸡胚的致病性存在一定差异:FL3株致鸡胚死亡率为45%,略高于MoGH3-3株(40%),二者均高于A3株(25%),但差异均不显著(P>0.05);FL3株鸡胚检测阳率为100%,高于MoGH3-3株(85%)及A3株(90%),但差异也不显著(P>0.05)。本试验初步确定了绵羊肺炎支原体可感染和致死SPF鸡胚,不同分离株对SPF鸡胚致病力有差异,表明SPF鸡胚可作为下一步建立绵羊肺炎支原体实验室感染模型的候选,为绵羊肺炎支原体致病性研究和疫苗研制奠定基础。

ND La Sota毒种在SPF鸡胚中增殖规律初探

为了探索ND La Sota弱毒株在SPF鸡胚中的增殖规律,保证生产用种毒的质量,我们采用不同的时间段来收获ND La Sota弱毒株感染的胚液,然后测定胚液的EID50.结果发现,SPF鸡胚在接种病毒后85～100h之间出现死亡高峰期,经病毒含量测定,该时段感染胚液比其他时间死亡的感染胚液病毒含量高出1.5～6倍以上,表明ND La Sota弱毒株的增殖高峰与SPF鸡胚接种后的死亡时间有重要关系.

关注我国SPF鸡胚生产

今年1月1日起,农业部对GMP疫苗生产企业疫苗菌(毒)种制备与鉴定、活疫苗生产以及疫苗检验使用无特定病原体(SPF级)鸡、鸡胚情况进行全面监督检查。对达不到标准要求的,将根据《兽药管理条例》规定进行处理。这就意味着我国对SPF种蛋生产企业、禽用活疫苗生产企业及其使用单位强制实施SPF化管理,兽药行业监管部门将加强禽用活疫苗生产SPF化的监督工作,全力推进禽用活疫苗生产的SPF化进程。

鸡毒支原体人工感染SPF鸡胚研究

试验使用低剂量的鸡毒支原体(MG)培养液(液稀释至10~4CCU/mL)经卵黄囊接种5~7日胚龄SPF鸡胚,结果:鸡胚死亡高峰时间发生在孵化后期(17d以后),疫苗6/85株导致SPF鸡胚死亡情况及死亡鸡胚病理变化与MG强毒S6株和临床分离株无明显差异。从孵化后期死胚中采集不同样品进行MG分离鉴定,最终确定死胚最佳分离部位为卵黄囊膜。

SPF鸡胚与普通鸡胚繁殖鸡新城病毒的比较试验

利用SPF鸡胚与普通鸡胚分别繁殖新城疫病毒,发现接毒后不同时间SPF胚蛋比普通胚蛋死胚率高,收获毒液血凝价和EID50比普通胚蛋也分别高出0.67和100.33。

SPF鸡胚孵化前后的营养成分对比研究

本试验旨在比较研究11日龄与0日龄的SPF鸡胚粉中的各种营养成分含量。选择济南赛斯家禽科技有限公司的11日龄与0日龄SPF鸡胚蛋,经蒸煮等前期处理后,用真空冷冻干燥机将SPF鸡胚蛋冷冻干燥后研磨成粉,利用凯氏定氮仪等仪器以及营养检测试剂盒对其营养成分进行检测。结果表明,11日龄的SPF鸡胚粉中的营养成分含量有变化,尤其牛磺酸、蛋白质、维生素E、钙、磷等营养成分显著优于0日龄SPF鸡胚粉,其中,牛磺酸提高为孵化前的10.1倍。本研究为SPF鸡胚粉研制以及进一步应用奠定了一定的理论基础。

SPF鸡胚需求状况及生产供应能力

据2006年度全国兽用生物制品批签发统计，禽用疫苗中，新城疫疫苗产量（367亿头份）最大，约占其他禽苗的一半左右（48．27％），其次足新支二联（12．83％）和传染性法氏囊病疫苗（12．43％），2005和2006年均超过了100亿头份，这三种疫苗占禽用疫苗的70％以上。鸡马立克疫苗（6．6％）、传支（4．9％）、鸡痘（4．6％）等疫苗约占20％，另约10％为其他的鸡用疫苗。在这些禽用疫苗中，绝大多数为活疫苗。按照规定，这些活疫苗必须用SPF鸡胚进行生产。

禽腺病毒血清4型Y17215-1株对SPF鸡胚及SPF鸡的致病性研究

为了探究一株禽腺病毒血清4型(FAdV-4)天津分离株Y17215-1对SPF鸡胚及SPF鸡的致病力,试验将Y17215-1株(病毒效价为1×10^(6.5) TCID_(50)/0.1 mL)经卵黄囊和尿囊膜两种接种途径分别接种6,10日龄SPF鸡胚,经滴鼻点眼和肌肉注射两种途径分别接种7,14,21日龄的SPF鸡,观察SPF鸡胚死亡情况和病理变化情况,统计SPF鸡发病死亡情况,检测试验鸡不同组织及不同采集时间的泄殖腔中的病原,观察试验鸡的临床病变和组织病理学变化。结果表明:两种接种途径均可致鸡胚死亡,经卵黄囊途径接种致死的鸡胚可见胚体全身出血,经尿囊膜途径接种致死的鸡胚尿囊膜明显增厚;两种接种途径均可引起不同日龄SPF鸡发病和死亡,且肌肉注射组试验鸡较滴鼻点眼组试验鸡发病快、病程短,致死率高,发病鸡临床表现为精神沉郁、采食量明显下降、排黄绿色粪便。心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃等器官病原检测结果均为阳性,各试验组的泄殖腔拭子样品在感染后第2天即可检测到FAdV-4。剖检可见典型的心包积水、肝脏肿大、肾脏肿大等病变,肝细胞内有嗜酸性包涵体。说明FAdV-4天津分离株Y17215-1对鸡胚及鸡具有较高致病性。

新生牛血清的质量控制对SPF鸡胚细胞和人二倍体(2BS)细胞生长的影响

目的考察新生牛血清质量控制对SPF鸡胚细胞和人二倍体(2BS)细胞生长的影响。方法选择来源可追溯性、工艺质量稳定,且检定合格的新生牛血清样品配制细胞生长液,用于SPF鸡胚细胞和2BS细胞的培养。待细胞生长成致密成纤维单层细胞,记录细胞成单层的时间,用胰酶消化细胞,通过全自动细胞计数仪对细胞悬液进行测定,观察总细胞数、活细胞数,计算细胞存活率。根据活细胞数计算MOI,分别用腮腺炎及风疹病毒接种SPF鸡胚细胞和2BS细胞,检测收获病毒液的滴度。结果SPF鸡胚细胞总细胞数不低于3.5×10~6个/mL,活细胞数不低于2.1×10~6个/mL,细胞存活率不低于60%;2BS细胞总细胞数不低于7.0×10~5个/mL,活细胞数不低于4.2×10~5个/mL,细胞存活率不低于60%。腮腺炎病毒原液滴度在6.1～6.6 lgCCID_(50)/mL之间,平均值为6.28 lgCCID_(50)/mL,SD为0.11,生产过程加工能力指数(process capability index,Cpk)为1.51,批间质量趋于一致;风疹病毒原液滴度均在5.5～6.2 lgCCID_(50)/mL之间,平均值为5.8 lgCCID_(50)/mL,SD为0.17,Cpk值为1.40,批间质量趋于一致。结论新生牛血清的质量良好,用其培养SPF鸡胚细胞和2BS细胞的活细胞比率可控,收获的病毒液滴度较均一,差异性较小。

我国SPF鸡(胚)供需日趋饱和

《中周兽药杂志》（2013年第9期）刊载毛娅卿、程水生等人撰写的《我国SPF鸡胚生产与质量控制现状分析》一文，文章指出，2012年，我国20家SPF鸡生产企业生产SPF鸡胚年产量约5050万枚，其中年产600万枚以上的企业有3家，