rot3、rot4、an和spk1在胡杨异形叶发生中的表达模式和作用

胡杨具有典型的异形叶性,是研究植物叶形发育的理想材料。但至今尚不清楚胡杨异形叶发生的分子调控机制。本研究以胡杨披针形和宽卵圆形幼叶为材料,利用qRT-PCR技术分析了参与叶基-顶轴发育的rot3和rot4基因、参与叶中-侧轴发育的an和spk1基因在胡杨异形叶发生中的表达模式,进一步分析了这些基因对胡杨异形叶发生的调控作用。发现rot3和spk1在披针形叶中的表达显著高于在宽卵圆形叶中表达,特别在叶形发育早期。而rot4和an则在宽卵圆形叶中的表达显著高于在披针形叶中表达,尤其是叶形发育早期。这暗示在胡杨叶形发育过程中,尤其是早期,rot3和spk1能促进胡杨叶形向披针形发育,而rot4和an则能促进胡杨叶形向宽卵圆形发育。同时也证明这4个预测基因在胡杨中是存在的,它们通过控制基-顶轴和中-侧轴极性建成调控胡杨异形叶的发生。

携带siSPK1重组腺病毒的构建及其对N2a细胞凋亡的影响

应用AdMax腺病毒载体系统构建携带siSPK1基因的重组腺病毒,进一步研究SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。设计可形成小发夹结构的SPK1-siRNA模板cDNA序列,克隆至质粒pDC316-siRNA,构建SPK1-siRNA穿梭质粒pDC316-SPK1,经鉴定正确后,将pDC316-SPK1与辅助包装质粒(pBHG loxΔE1,3 Cre)共转染至HEK293细胞,包装纯化并扩增重组腺病毒颗粒,终点稀释法测定病毒滴度;病毒感染N2a细胞,Western blot法检测SPK1蛋白的表达;Hoechst33258染色检测SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。酶切后PCR分析、测序鉴定表明,pDC316-SPK1构建成功,病毒纯化后滴度为2.50E+10 PFU/mL;重组病毒可在蛋白水平抑制SPK1的表达;SPK1基因抑制后,N2a细胞凋亡增加(P<0.001)。上述结果表明,含有SPK1-siRNA的重组腺病毒构建成功,且具有抑制SPK1蛋白表达的功能,该基因沉默后,N2a细胞凋亡增加。

SPK调节低氧诱导白血病细胞增殖及糖代谢的实验研究

目的:应用人红白血病TF-1细胞系模型,研究SPK信号通路在细胞增殖和糖代谢中的作用。方法:应用慢病毒介导的shRNA干涉策略,干涉TF-1细胞中SPK的表达。通过RT-q PCR和蛋白印迹技术检测SPK在TF-1细胞中干涉效率。应用CCK-8测定细胞增殖活力,通过流式细胞仪检测Annexin V染色确定细胞凋亡情况。结果:低氧能够诱导TF-1细胞中HIF-1α、HIF-2α和SPK的上调,证明SPK是低氧诱导表达的重要分子。SPK-shRNA转染能够明显抑制TF-1细胞的增殖并且诱导TF-1细胞的凋亡。SPK敲减明显减低细胞葡萄糖的利用和消耗。结论:SPK是参与调节低氧诱导细胞增殖和葡萄糖代谢的关键信号分子,在低氧诱导细胞反应中发挥重要作用。

鞘鞍醇激酶-1对胰腺癌SW1990细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨鞘鞍醇激酶-1(SPK1)对胰腺癌SWl990细胞增殖和凋亡的影响。方法培养的胰腺癌SW1990细胞株,实验分为DMS组、PMA组和对照组,各组细胞接种于孔板中,每组设3个复孔,每个实验至少重复3次。DMS组加入N,N-二甲基鞘氨醇(DMS,50μmol/L),PMA组加入佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA,100 nmol/L),对照组按常规培养,采用MTT法和克隆形成实验检测细胞生长增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR检测SPK1 mRNA的表达,Western blot检测SPK1蛋白的表达。结果 PMA组细胞的增殖活力[OD值:(1.37±0.03),细胞克隆数目:(292.45±10.68)]较对照组[OD:(1.00±0.01),细胞克隆数目:(215.34±12.23)]显著增加,DMS组细胞的增殖活力[OD值:(0.65±0.02),细胞克隆数目:(130.56±15.6)]较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。PMA组细胞凋亡率[(9.7±0.62)%]较对照组[(16.71±1.53)%]明显下降,DMS组细胞凋亡率[(31.7±1.32)%]较对照组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01),PMA组SPK1 mRNA表达水平(0.202±0.013)及蛋白表达水平(0.258±0.015)较对照组[SPK1 mRNA:(0.148±0.006),蛋白:(0.182±0.044)]显著增加,而DMS组SPK1 mRNA表达水平(0.112±0.022)及SPK1蛋白表达水平(0.101±0.034)较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 SPK1与胰腺癌细胞的增殖和凋亡密切相关,SPK1的激活可促进胰腺癌细胞的增殖并抑制细胞的凋亡。

鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号对老年脐静脉内皮细胞增殖及迁移能力的影响研究

目的:探讨鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPK1)及1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)对老年脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖及迁移能力的影响。方法:通过实验确定pLKO.1-shSPK1-GFP干涉慢病毒及pPIG-U6-Scramble-GFP对照慢病毒的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),并用最佳MOI感染HUVECs。48 h后提取细胞的蛋白质及RNA,蛋白免疫印迹法(western blot,WB)及实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)检测HUVECs内SPK1的蛋白和基因表达水平。用SPK1干涉慢病毒及对照病毒或S1P处理HUVECs,细胞活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCKit-8)检测细胞的增殖能力,Transwell检测细胞的迁移能力。结果:用最佳感染复数20 MOI的慢病毒感染HUVECs 48 h后,其SPK1的蛋白和基因表达水平均显著下调50%左右(P<0.01或P<0.05)。CCKit-8增殖实验及Transwell迁移实验表明,干涉SPK1可以显著抑制HUVECs的增殖及迁移能力(P<0.01)。而100 nM及200 nM S1P则可以显著促进HUVECs的增殖及迁移能力(P<0.01)。结论:HUVECs内SPK1表达水平的下降可以显著抑制HUVECs的增殖及迁移能力,而其催化产物S1P则可以促进HUVECs的增殖及迁移能力。

低氧条件下白藜芦醇对HepG2细胞增殖及自噬的调节作用及初步机制

白藜芦醇(resveratrol)是天然存在于葡萄、红酒及花生等中的一种多酚类化合物,具有抗癌、抗氧化等作用.目前针对resveratrol抗癌作用的研究大多侧重于常氧状态,而对于更接近体内肿瘤生长环境即低氧状态的研究相对匮乏.本文以肝癌细胞HepG2为模型,探讨了低氧(1%O2)条件下resveratrol抑癌的相关功能和机制.结果表明,在低氧状态下resveratrol不仅抑制HepG2细胞的活性,而且也促进了低氧诱导的自噬保护机制;进一步研究发现,去乙酰化酶Sirt1和鞘氨醇激酶SPK1也参与上述过程.本文初步揭示了低氧状态下癌细胞对resveratrol敏感性低的可能机制,更加明确resveratrol在实体瘤中的抗癌作用,并为resveratrol的药物研发提供了借鉴.