PdbSPL28基因过量表达提高山新杨对叶斑病的抗性

【目的】SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的一类转录因子,对植物生长发育以及天然免疫反应至关重要。本研究通过在山新杨中过表达PdbSPL28基因,分析比较野生型和转基因山新杨在抗病方面的表型差异,探究PdbSPL28基因的生物学功能及其对杨树抗病性的影响,为深入解析该基因调控杨树抗病性的分子机制提供基础。【方法】利用同源克隆获得山新杨PdbSPL28基因完整ORF序列,并利用DNA人工合成技术对该基因ORF中的miR156作用位点进行序列改造,采用酶切、连接反应分别将改造前和改造后的PdbSPL28基因序列构建过表达载体;采用Gateway技术构建亚细胞定位载体,利用烟草叶片瞬时转化系统分析PdbSPL28蛋白亚细胞定位;利用农杆菌介导的叶盘转化法获得PdbSPL28基因过量表达的转基因山新杨,基于刺伤接种法和石蜡切片技术,观察野生型和转基因山新杨对2种间座壳属病原菌(Diaporthe nobilis和D.cercidis)的抗性差异及叶片解剖结构变化并测定病情指数;制备病原菌D.nobilis孢子悬浮液,接种野生型和2个过表达株系的离体叶片,在接种后不同时间点采集样品,通过液质联用方法检测茉莉酸含量变化。【结果】山新杨PdbSPL28基因ORF全长1341 bp,序列中含有1个miR156作用位点;PdbSPL28蛋白含有保守的SBP结构域,定位于细胞核。对PdbSPL28基因ORF中miR156作用位点改造后,成功获得6个该基因过量表达的转基因株系。与野生型相比,PdbSPL28过表达山新杨对2种间座壳属病原菌的抗性明显增强。茉莉酸测定结果显示:在接种前,PdbSPL28过表达株系叶片中茉莉酸含量高于WT;但在接种96 h时,过表达株系茉莉酸含量极显著低于WT。【结论】对miR156作用位点进行序列改造,可以提高获得PdbSPL28基因过量表达转基因山新杨的概率;PdbSPL28基因过表达可以提高山新杨对间座壳属真菌引起的叶斑病抗性,茉莉酸信号途径可能在过表达株系响应D.nobilis侵染过程中发挥重要作用。