杆状病毒SpltMNPV病毒粒子中存在泛素复合物

通过间接免疫荧光分析,发现在斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodopteralituranucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)感染的Sl＿zsu＿1细胞的细胞质中存在大量的泛素或泛素复合物。Western印迹分析表明,在SpltMNPV多角体源病毒粒子与芽生型病毒粒子中均存在相对分子质量为30×103～65×103的泛素复合物。推测SpltMNPV在出芽或组装的过程中由感染细胞的胞质中获得泛素复合物。

杆状病毒SpltMNPV ORF124基因截短片段的克隆与表达

目的:克隆并表达斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhe drovirus,SpltMNPV)ORF124基因的部分编码序列。方法:用PCR方法扩增目的基因序列片段,并将其克隆至原核表达载体pQE-30上,转化到Escherichia.coli M15[pREP-4]中进行诱导表达。结果:构建了pQE-tr124原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导表达了一个与预期理论值相符的约为33kDa的蛋白。以Ni2+-NTA偶连抗体检测证明所表达的蛋白为带有组氨酸的融合蛋白。结论:成功表达了SpltMNPV ORF124的部分编码序列,该融合蛋白的成功表达为进一步深入研究基因的功能奠定了基础。

表达蝎毒素的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)的构建及毒力

【目的】开发高毒力的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedroviruse,SpltMNPV)杀虫剂。【方法】构建编码蜕皮激素UDP-葡萄糖基转移酶(ecdysterioid UDP-glucosyl transferase gene,egt)基因缺失并插入东亚钳蝎神经毒素(B.martensi Karsch,BmK ITa1)基因的重组转移载体,重组转移载体与SpltMNPVⅡ基因组DNA共转染斜纹夜蛾细胞,通过荧光斑法与有限稀释法相结合筛选重组病毒。【结果】成功筛选出缺失egt基因的、早期启动子(ie-1)启动的、表达BmK ITa1成熟肽的重组病毒SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-ie-1-BmK ITa1。生物测定结果显示,重组病毒的杀虫速度(LT50)较野生病毒提前0.7-0.8 d。【结论】通过在SpltMNPV病毒基因组中插入外源毒素基因可明显增强病毒的杀虫效果,结果说明开发高毒力SpltMNPV生物杀虫剂具有可行性。

斜纹夜蛾核多角体病毒p49基因在大肠杆菌中的表达及其在昆虫细胞中的表达时相分析

利用PCR方法从斜纹夜蛾核多角体病毒 (SpltMNPV)基因组中扩增获得了细胞凋亡抑制基因p4 9的完整ORF并将其克隆于pMD1 8 T载体 ,其序列分析结果与文献报道一致。将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisC ,在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中获得了稳定表达 ,表达的P4 9融合蛋白占菌体总蛋白 30 %左右 ,主要以包涵体形式存在。分离纯化重组表达的SpltMNPVP4 9蛋白作为抗原 ,免疫家兔制备得到效价高于 1∶1 0 0 0 0的抗重组P4 9蛋白多克隆抗体。应用制备的抗体对受SpltMNPV感染的Sl细胞中P4 9蛋白的表达时相进行分析 ,结果显示P4 9蛋白在细胞感染后 3h内便可检测到 。

斜纹夜蛾核多角体病毒gp37及其邻近序列的克隆及分析

从斜纹夜蛾核多角体病毒 (Spodopteralituranucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)基因组中克隆了 gp37基因 .分子生物学软件分析表明 ,在 gp37基因内部存在糖基化位点 .含有晚期表达基因的启动子序列(ATAAG) ,推测为晚期表达的病毒膜糖蛋白基因 .通过GP37蛋白的同源性比较 ,绘制了以 gp37基因为基础的杆状病毒进化树 ,发现与以多角体蛋白基因 (polyhedrin)为基础所绘制的杆状病毒分子进化树有较大差异 .以polyhedrin基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树将家蚕核多角体病毒 (Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)与杆状病毒代表种———苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (Autographacalifornicamultinucleocapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)分开 ,根据 gp37基因分析则将二者归到同一分枝 。

核多角体病毒对斜纹夜蛾成虫及其后代的影响

本文研究了核多角体病毒(SpltMNPV)对斜纹夜蛾Spodoptera litura成虫及子代幼虫的生存、繁殖、生长发育等的影响。结果表明,斜纹夜蛾成虫通过补充营养摄入病毒后,平均寿命及单雌产卵量明显下降,雄性单独摄入、雌性单独摄入、雌雄同时摄入SpltMNPV的平均单雌产卵量分别为1213、1340、1087粒,而未摄入SpltMNPV的单雌产卵量为1530粒。成虫摄入病毒,对子代种群有很好的控制作用。仅雄性或雌性单独摄入病毒,对子代幼虫种群控制作用干扰指数(IIPC)分别为0.2658和0.3046;而雌雄成虫同时摄食后,其后代的IIPC值为0.1807。

C型斜纹夜蛾核型多角体病毒X_(17)病毒株部分基因的序列分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multinucleocapsid nucleopolyhdrovirus,SpltMNPV)X17株是采用活体克隆法自SpltMNPV日本小笠原株分离的病毒克隆。为了揭示X17病毒株基因型,根据已发表的SpltMNPVⅡ基因组全序列(GenBank登录号:NC_011616)设计引物,PCR扩增多角体蛋白基因(polh),并与SpltMNPV不同基因型及37种其他核型多角体病毒(NPV)作分子进化比较。系统发育树显示:SpltMNPV分为SpliNPV(A)型、SpltMNPV(B)型和SeMNPV(C)型3种基因型,此结果与前人利用基因组酶切图谱的研究结果一致。X17与SpltMNPV-1和SpltMNPVⅡ处于一个分支,属于SeMNPV(C)基因型,与A型和B型相距较远。此外,扩增了X17病毒基因38.7kD,Lef-1,Lef-9,fp,p10和p74,并与SpltMNPV,SpltMNPVⅡ,SeMNPV和SfNPV的同种基因进行同源性比较。结果表明,基于这6个ORF,X17与SpltMNPV同源性最低,其中Lef-9的氨基酸序列一致性最高,也仅为69%,38.7kD的氨基酸序列一致性只为26%。多数基因X17与SpltMNPVⅡ和SeMNPV的同源性较高,其中fp25K的氨基酸序列一致性最高,分别达95%和96%;但也有些基因同源性较低,如38.7kD的氨基酸序列一致性均为64%。因此,X17应是SpltMNPVC基因型的一种新毒株,命名为SpltMNPVⅡ-1。该研究为X17病毒株的进一步研究利用奠定基础。

斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白原核表达

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39,转化Escherichia.coliBL21(DE3),在1mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60kDa的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。

斜纹夜蛾多角体病毒包埋型病毒受体的鉴定

蔗糖密度梯度离心法提纯斜纹夜蛾核多角体病毒（＄Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｄｒｏｖｉｒｕｓ， ＳｐｌｔＭＮＰＶ）包埋型病毒粒子（ｐｏｌｙｈｅｄｒａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＰＤＶ），以此病毒粒子作抗原，免疫家兔获得抗血清；用ＳＤＳ裂解缓冲液提取斜纹夜蛾幼虫中肠组织细胞总蛋白。采用病毒铺覆蛋白印迹技术（ＶＯＰＢＡ），利用抗ＰＶＤ抗血清对病毒受体进行检测，结果表明斜纹夜蛾中肠细胞总蛋白中４０ｋＤ、７３ｋＤ、８５ｋＤ的三种蛋白能够结合ＰＤＶ。

斜纹夜蛾核多角体病毒诱导甜菜夜蛾细胞凋亡的研究

斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multiple nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)不能成功感染亲缘关系相近的甜菜夜蛾Spodoptera exigua,为了探究其中原因,取SpltMNPV感染甜菜夜蛾离体细胞Se301,利用光学显微镜,电子显微镜以及DAPI(4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)荧光染色等方法对其进行检测。结果显示Se301细胞被SpltMNPV感染后出现早期凋亡特征,但未进行至细胞凋亡晚期形成凋亡小体;病毒感染受到阻碍,始终没有病毒多角体和有感染性的芽生型子代病毒产生;综合以上结果说明早期细胞凋亡仍然是限制病毒完成复制周期的重要因素。