人SPOP真核表达质粒的构建及其在胃癌细胞中的表达

目的构建人pUB6/V5-HisB-SPOP真核表达质粒及稳定表达外源性人SPOP基因的人胃癌AGS细胞系。方法采用基因重组技术将人SPOP cDNA插入真核表达载体pUB6/V5-HisB,构建人pUB6/V5-HisB真核表达质粒。脂质体介导空载体pUB6/V5-HisB和表达质粒pUB6/V5-HisB-SPOP分别转染人胃癌AGS细胞株,杀稻瘟菌素筛选阳性克隆,扩大培养,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测SPOP mRNA和蛋白表达。结果双酶切和基因测序结果均证实人pUB6/V5-HisB-SPOP真核表达质粒构建成功。SPOP转染组与空白对照组、空载体组比较,SPOP蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论成功构建人SPOP真核表达质粒并获得稳定表达SPOP基因的胃癌AGS细胞系,为进一步研究SPOP基因在胃癌发生发展中作用奠定实验基础。

鸡SPOP和MyD88基因分子特征及其组织表达特性分析

【目的】掌握SPOP和MyD88基因分子特征及其在鸡不同组织发育过程中的表达特征,为后续研究其调控鸡组织生长发育机理及开展抗病育种提供参考依据。【方法】通过RT-PCR克隆鸡SPOP和MyD88基因编码区(CDS)序列,运用ExPASy、SOPMA、SWISS-MODEL及PSORT II Prediction等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测这2个基因在鸡胚14胚龄(E14 d)及出壳后1 d(H1 d)、7 d(H7 d)和14 d(H14 d)各组织中的表达情况。【结果】鸡SPOP、MyD88基因CDS序列长为1125和900 bp,分别编码374和299个氨基酸残基。SPOP蛋白分子式为C_(1866)H_(2926)N_(496)O_(559)S_(28),相对分子量为42 kD,理论等电点(pI)为5.58,为相对不稳定蛋白;MyD88蛋白分子式为C_(1502)H_(2394)N_(410)O_(438)S_(18),相对分子量为33 kD,pI为5.93,为相对不稳定蛋白。鸡SPOP和MyD88蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,主要定位于细胞质(占60.9%)。与人类和哺乳动物相比,鸡SPOP蛋白的3个功能结构域(MATH、BTB-POZ和BACK)较保守,而MyD88蛋白的2个功能结构域(Death和TIR)存在多处氨基酸位点变异。SPOP和MyD88基因在鸡不同发育阶段各组织中均有表达,但以肺脏中的相对表达量最高,且二者间的表达差异极显著(P<0.01,下同)。从E14 d发育至H14 d,SPOP基因在眼球和肺脏中的表达整体上呈上升趋势,且至H14 d时肺脏中的表达趋于稳定,在脑组织、心脏和肌胃中的表达呈先上升后下降的变化趋势,在肝脏中的表达呈先下降后上升再下降的变化趋势;MyD88基因在眼球、肝脏和肺脏中的表达均呈先上升后下降再上升的变化趋势,在肌胃和胸肌中的表达呈下降趋势,至H14 d时降至最低值。【结论】SPOP和MyD88基因在鸡胚不同发育阶段肺脏、眼球和肌胃中的表达相对较高,SPOP基因的表达水平均极显著高于MyD88基因,且二者的相对表达量呈负相关,即SPOP基因负调控MyD88基因的表达。

E3泛素连接酶接头蛋白SPOP介导的底物非降解型泛素化修饰

蛋白质的翻译后修饰是保证其能正常行使功能的前提,泛素化修饰是维持细胞正常蛋白质水平和活性的重要翻译后修饰类型。近年来,大量研究发现,E3泛素连接酶斑点型锌指结构蛋白(speckle-type POZ protein,SPOP)在诸多肿瘤与遗传疾病中存在突变,这些突变主要集中在识别底物的MATH结构域影响了与底物之间的结合,进而影响底物的蛋白质水平、定位及活性,并扰乱正常生理功能从而诱发疾病。野生型SPOP能正常结合底物,这些底物绝大多数由SPOP泛素化后进入蛋白酶体途径降解,而也有个别重要底物泛素化后仅是影响其功能改变而并非蛋白质水平的变化。鉴于SPOP在细胞内的重要功能,本文将对SPOP的底物泛素化修饰类型及功能进行详细介绍。包括:泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS),SPOP的结构、功能和作用途径以及SPOP的非降解型泛素化修饰。重点围绕SPOP的3个非降解底物:髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)介导的NF-κB信号通路、组蛋白macroH2A1(macroH2A.1 histone,macroH2A1)的X染色体沉默信号通路,以及成蛋白INF2(inverted formin 2)介导的线粒体分裂融合等信号通路,将其抑制肿瘤发生发展的分子机制进行总结,以期为肿瘤精准靶向治疗提供新思路。