石蒜SRAP-PCR扩增体系的建立与优化

以陕西产野生石蒜〔Lycorisradiata (L’Hr.)Herb.〕为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度及Taq DNA聚合酶用量对石蒜SRAP分子标记扩增体系的影响,并对扩增体系进行了优化。优化后的反应体系总体积为10μL,含20ng模板DNA、3.0mmol·L-1Mg2+、0.20mmol·L-1dNTPs、0.4μmol·L-1引物和0.50UTaq DNA聚合酶。运用优化体系对9个石蒜居群的基因组DNA进行扩增,获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明SRAP-PCR可用于石蒜属植物的亲缘关系、系统演化、物种鉴别和遗传多样性等领域的研究。

苎麻基因组SRAP扩增体系的优化研究

以苎麻自交系品种为材料,研究了苎麻SRAP分析过程中的影响因素,包括10×PCRBuffer、模板浓度、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、循环次数、退火温度等,建立了适于苎麻SRAP分析的PCR反应体系:即在20μl反应体系中,引物浓度为0.3μmol/L;模板DNA的用量为60￣100ng;Mg2+浓度为2.0mmol/L;dNTP浓度为0.2mmol/L;Taq酶用量为1U。适宜的扩增程序为先94℃变性1min,前5个循环以94℃变性1min、33℃复性1min、72℃延伸1min进行,接下来将复性温度提高到52℃,其它条件不变,进行30个循环,最后72℃延伸5min,4℃保存。本文讨论了SRAP分子标记在苎麻上的应用前景,提出了应用SRAP分子标记构建苎麻遗传图谱的可行性。

香菇SRAP扩增体系的建立与优化

为了建立稳定的香菇(Lentinula edodes)SRAP(sequence-related amplified polymorphis m,相关序列扩增多态性)分子标记技术体系,以香菇(Lentinula edodes)为材料,采用SDS-CTAB(sodium dodecyl sulfate-cetylri methylammoniumbromide)法提取菌丝体基因组DNA,用琼脂糖检测扩增产物,筛选优化了SRAP扩增条件。可用于香菇SRAP分析的最佳PCR条件为20μL PCR反应体系中,模板DNA25ng,Buffer l×,Mg2+2.5mmol/L,dNTP Mixture0.2mmol/L,引物0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5U。优化后的SRAP体系目标条带增多,重现性好。

小麦基因组SRAP扩增体系的初步研究

对影响SRAP扩增结果的各种因素包括DNA、引物、dNTPMixture、TaqDNA聚合酶的浓度及变性、复性、延伸的时间及温度进行了摸索。获得了能够稳定扩增小麦基因组的体系:20μL体系中DNA25ng,dNTP188mmol/L,TaqDNA聚合酶0 75U,引物25ng。扩增程序为:94℃1min,37℃1min,72℃10sec,5个循环;94℃1min,50℃1min,72℃10sec,35个循环;72℃1min。

怀地黄SRAP扩增体系的建立与引物的筛选

为建立适合怀地黄SRAP-PCR分子标记技术体系,通过单因子实验分别研究了DNA模板浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及dNTP浓度对怀地黄SRAP扩增反应的影响,确立了适合怀地黄SRAP最佳反应体系为:在25μL的反应体系中,模板DNA量20ng/25μL、2.5mmol/LMg2+、0.32μmol/L的上下游引物、0.30μmol/L的dNTP以及2.5UTaq酶,并利用确定的体系从88个引物组合中筛选出12对适合怀地黄SRAP-PCR反应的引物。

小麦叶片cDNA-AFLP扩增反应体系的优化

【目的】建立并优化小麦叶片cDNA-AFLP扩增反应体系,进行cDNA-AFLP分析,挖掘新春6号相关抗旱基因。【方法】在盆栽小麦苗期水分胁迫下叶片cDNA-AFLP的试验中,分别对20μL预扩增和选择性扩增反应体系中的4种反应条件影响因子进行不同梯度优化的研究,包括引物、dNTP、Mg2+及TaqDNA聚合酶的用量。【结果】PCR预扩增20μL反应体系中,引物(40 mM)1.0μLd、NTP(2.5 mM)1.8μL、Mg2+(25 mM)2.2μL、TaqDNA聚合酶(5U)0.5μL时预扩增效果较好;PCR选择性扩增20μL反应体系中,引物(40 mM)0.6μL、dNTP(2.5 mM)2.0μL、Mg2+(25 mM)1.6μL、TaqDNA聚合酶(5U)0.4μL时,可得到更多清晰可辨的TDFs(transcriptderived fragments)。【结论】试验通过对引物、dNTP、Mg2+、TapDNA聚合酶用量等因子进行筛选,获得较为理想的预扩增和选择性扩增体系,得到了更多有效的条带,为利用cDNA-AFLP研究小麦抗旱相关基因的分离及其克隆奠定了良好的基础。

马褂木ISSR-PCR扩增体系的优化

【目的】建立稳定的马褂木ISSR-PCR扩增体系,为马褂木种群ISSR多样性分析提供技术支持。【方法】采用单因素试验对ISSR-PCR扩增体系中的MgCl2、dNTPs、引物浓度、TaqDNA聚合酶、DNA模板用量和退火温度等主要因素进行筛选优化。【结果】采用试剂盒方法提取马褂木叶片DNA的效果优于改良CTAB法,最优PCR反应体系为:总体积20.0μL中含有10×Buffer2.0μL、MgCl21.8mmol/L、dNTPs0.2mmol/L、引物0.5μmol/L、TaqDNA聚合酶1.00U、DNA模板60ng、退火温度59.1℃。【结论】优化后的马褂木ISSR-PCR扩增体系能够扩增获得清晰、稳定的条带,可满足马褂木种群ISSR多样性分析的要求。

枣选择性扩增微卫星体系的建立及优化

【目的】建立和优化枣的选择性扩增微卫星(SAM)技术体系,丰富枣群体遗传学研究的方法,同时为枣利用SAM法开发SSR引物提供技术参考和模板。【方法】以冬枣、大荔龙枣和金丝小枣为试材,采用CTAB法提取样品DNA,对SAM试验过程中的酶切-连接、抑制性扩增、预扩增、选择性扩增等关键因子进行研究。【结果】利用PstⅠ和MseⅠ双酶切系统,分步法进行酶切-连接是后续试验成功的关键,抑制性扩增(20.0μL体系)模板取酶切连接液2.0μL,预扩增和选择性扩增(20.0μL体系)的模板分别取上步扩增的稀释产物各2.0μL;抑制性扩增和预扩增反应中,ExTaq取0.5U,反应25个循环,产物稀释20倍进行下一步扩增;选择性扩增采用前6个循环中退火温度梯度降低(每循环降低1℃)的反应程序,体系中可将ExTaq用量增加到1.0U以保证酶的保真效果。【结论】试验利用优化后的反应体系,选用16个MseⅠadapter+NN primer和SSR primer(PCT6)组成引物对进行筛选,获得了谱带清晰、分辨率高、多态性丰富的电泳图谱。该研究结果为利用SAM技术开展枣的亲缘演化、遗传多样性分析及SSR引物开发等方面的研究打下了基础。

水稻叶片cDNA-AFLP选择性扩增反应体系的优化

在水稻Oryza sativa叶片响应稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis取食后的cDNA-AFLP试验中,对25μL体系中预扩增和选择性扩增的引物浓度、dNTP浓度、镁离子浓度及TaqDNA聚合酶用量4种反应条件影响因子进行不同梯度的优化研究。结果表明,PCR选择性扩增反应时,总反应液25μL体系中引物浓度为0.2μmol/L、dNTP浓度为0.2mmol/L、镁离子浓度为2.0mmol/L、TaqDNA聚合酶用量为13.336n kat/25μL时,可得到更多鲜明可辨的TDFs。

松属部分种的ISSR-PCR扩增体系优化及鉴别

对松属部分种的ISSR-PCR的反应体系及扩增程序进行优化,并进行种质鉴别。优化的10μL扩增体系为:Taq酶0.5 U,10×Buffer(Mg2+free),dNTP 0.35 mmol/L,Mg2+2.25 mmol/L,20ng DNA,0.8μL引物。扩增程序为:94℃预变性7 min,然后进行40个循环:94℃变性30 s,56℃退火45 s,72℃延伸2 min;最后72℃延伸7 min,4℃保温。从100条UBC系列引物中筛选出5条特异性强、稳定性好的引物UBC823、UBC840、UBC841、UBC855、UBC873,扩增的特异性条带可对松属的7个种进行鉴别。

细菌随机扩增DNA多态性反应体系优化

目的:对RAPD的反应体系进行优化,以期建立稳定的临床检测系统,在控制院内感染的流行病研究中发挥更大的作用。方法:用RAPD技术进行基因分型。结果:引物浓度:浓度为0·5μmol/L时扩增最好。DNA模板:浓度在0·50ng/μl、2ng/μl均得到了良好的扩增效果。镁离子浓度:在2·0mmol/L、4mmol/L时扩增效果较好。退火温度:在30℃时扩增条带最清晰。循环参数:在35、45个循环时扩增效果均好。结论:本试验对RAPD反应条件进行优化,建立了较稳定的临床检测体系。

薏苡ISSR-PCR扩增体系的优化

采用改进的SDS法提取薏苡种子胚基因组DNA,测试薏苡ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试Mg2+、dNTP、BSA、引物浓度及模板DNA、TaqDNA聚合酶用量等6个因素对ISSR-PCR扩增结果的影响。结果显示,10μl PCR反应体积中包括:1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH值9.0,50 mmol/LKCl,0.1%Triton X-100),1.75 mmol/L Mg2+,0.6 mmol/L dNTP,1 mg/ml BSA,10 ng模板DNA,20 pmol引物,0.45 UTaq酶。

鼠曲草简单重复序列间扩增反应体系的建立及优化

目的通过建立并优化鼠曲草简单重复序列间扩增(ISSR-PCR)反应体系,为鼠曲草后续遗传多样性研究提供实验依据。方法本研究首先采用单因素实验法和全面实验法优化鼠曲草ISSR-PCR反应体系,然后在最适体系下,分步进行引物及其退火温度的筛选,最后验证该体系的可行性。结果ISSR-PCR最适反应体系包括10μl Premix Taq DNA聚合酶、0.3μmol/L引物、10 ng DNA模板、灭菌水加至20μl;从100条通用引物中最终筛选出10条引物;验证结果表明该体系稳定性高、重复性好,且选定引物多态性好。结论本研究首次建立了鼠曲草ISSR-PCR扩增体系,并筛选出合适的引物,为鼠曲草后续遗传多样性研究夯实了基础。

香蕉基因组SRAP反应体系的建立和优化

为建立并优化适于香蕉(Musaspp.)SRAP分析的扩增体系,对影响香蕉SRAP反应的dNTP、Mg2+、模板DNA、引物浓度和Taq酶用量等因素进行优化。确定的优化扩增体系为Mg2+2.5mmol.L-1,dNTP250μmol.L-1,Taq酶1.0U,引物0.5μmol.L-1,模板DNA20ng,10×PCRbuffer2.5μL,在此条件下SRAP扩增香蕉基因组DNA条带清晰,多态性丰富。该体系在29个香蕉基因组中获得较好的扩增结果,可望在香蕉植物起源和进化研究中应用。

香菇SRAP反应体系的优化

为建立并优化适于香菇(Lentinulaedodes)SRAP(Sequence-related amplified polymorphism,相关序列扩增多态性)分析的扩增体系,通过单因子实验分别研究了dNTP、Mg2+、模板DNA、引物浓度和Taq酶用量对香菇SRAP反应的影响。试验获得的25μL优化扩增体系为Mg2+2.5mmol/L,dNTPs250μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.5μmol/L,模板DNA20ng,10×PCR buffer2.5μL,此条件下SRAP扩增香菇菌丝DNA条带清晰,多态性丰富。

均匀设计优化杨属的SRAP-PCR反应体系

采用均匀设计方法,对影响杨属SRAP-PCR体系的MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板浓度等因素分别进行了U16(45)和U12(35)两轮优化,建立了适用于杨属的SRAP-PCR反应体系。在25μL反应体系中,MgCl23.5mmol/L、dNTPs0.20mmol/L、引物0.44μmol/L、TaqDNA聚合酶1.50U、模板浓度28ng/L为最适条件。在此基础上又对退火温度进行了摸索,结果发现,扩增结果对退火温度变化不敏感。最后运用优化体系对杨属3派10个种共16个单株的DNA进行扩增验证,结果获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明这一优化的SRAP-PCR反应体系可用于杨属不同种间亲缘关系、系统进化和遗传多样性等方面的研究。

莴苣属蔬菜资源SRAP标记PCR体系的构建与优化

以莴苣为材料研究了影响SRAP标记PCR结果的因素,包括Mg2+、dNTP、引物、Taq酶的浓度以及退火温度等,建立了适用于莴苣属蔬菜SRAP分析的PCR反应体系:在20μl反应体系中,模板DNA为50ng,Mg2+浓度为2.0mmol/L,dNTP浓度为0.2mmol/L,引物浓度为0.75μmol/L,Taq酶用量为1U。适宜的扩增程序为94℃5min;94℃1min,35℃1min,72℃1min,5个循环;94℃1min,51℃1min,72℃1min,30个循环;72℃7min。对体系的验证结果表明本研究建立的莴苣SRAP体系重复性好、分辨率高、多态性丰富,在莴苣属蔬菜种质资源评价、分子标记辅助选择育种等多方面都有重要作用。

新型分子标记―SRAP技术体系优化及应用前景分析

基于PCR的分子标记技术很多,但均因自身缺点限制了发展和应用。一种新兴的分子标记技术-相关序列扩增多态性SRAP(Sequence-RelatedAmplifiedPolymorphism)以其特有的优点得到日益广泛的应用,显示了良好的发展前景。此技术在国外较多应用,但国内利用较少。以西瓜为材料对技术体系各影响因素进行调整,优化反应体系,比较DNA提取方法,调整银染技术,得到很好的扩增效果,同时对SRAP的原理、特点和应用前景进行了介绍。研究表明,SRAP将成为研究领域一个有力的工具。

橄榄基因组DNA提取及RAPD扩增条件优化

以橄榄叶片为材料,进行橄榄基因组DNA提取及RAPD扩增条件优化。试验表明,采用改良的SDS法,提取的DNA质量较高,适宜于RAPD分析。在25μL反应体积中,RAPD反应的优化体系为:18.5μLddH2O,0.5μLdNTP,2.5μlBuffer,1μL引物,0.5μLDNA模板,2μLTaqDNA聚合酶。

怀地黄SRAP分子标记优化体系的建立

为了建立适宜怀地黄的SRAP反应体系,以22个不同类型的怀地黄品种为材料,研究了PCR反应体系的主要成分对SRAP扩增结果的影响。对SRAP反应体系中的DNA模板浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及dNTP浓度进行了探索,确立的适合怀地黄SRAP反应的体系为:在25μL的反应体系中,模板DNA20ng、2.5mmol·L-1Mg2+、0.32μmol·L-1的上下游引物、0.30mmol·L-1的dNTPs以及2.5UTaq酶。并利用该反应体系对怀地黄22个不同品种进行了SRAP反应,发现不同品种间的DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠,可以用于怀地黄的分子标记研究。