均匀设计优化杨属的SRAP-PCR反应体系

采用均匀设计方法,对影响杨属SRAP-PCR体系的MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板浓度等因素分别进行了U16(45)和U12(35)两轮优化,建立了适用于杨属的SRAP-PCR反应体系。在25μL反应体系中,MgCl23.5mmol/L、dNTPs0.20mmol/L、引物0.44μmol/L、TaqDNA聚合酶1.50U、模板浓度28ng/L为最适条件。在此基础上又对退火温度进行了摸索,结果发现,扩增结果对退火温度变化不敏感。最后运用优化体系对杨属3派10个种共16个单株的DNA进行扩增验证,结果获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明这一优化的SRAP-PCR反应体系可用于杨属不同种间亲缘关系、系统进化和遗传多样性等方面的研究。

辣椒SRAP-PCR反应体系的建立与优化

SRAP标记(Sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)是由Li和Quiros发展了一种新的分子标记技术。SRAP标记具有简便、稳定、中等产率、在基因组中分布均匀的特点,已经应用于在水稻、棉花、油菜、马铃薯、苹果、柑橘类果树、樱桃、梅子、大蒜、莴苣及芹菜等植物和水稻稻瘟病的研究中,对开展遗传图谱构建、基因定位与克隆、比较基因组学、cDNA指纹图谱、生物多样性研究、预测杂种优势等研究是一个十分实用的工具。本研究对辣椒SRAP反应体系的程序、模板、Mg2+等参数进行优化研究,结果表明:辣椒的PCR程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5循环,94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,35循环,最后72℃延伸10min;25滋l反应体系中,模板量为15ng,Mg2+为2.0mmol/L。本研究建立的辣椒SRAP体系重复性好、稳定性强。

灵芝三萜高产菌株原生质体紫外诱变选育

对灵芝(Ganoderma lucidum)HG菌株进行原生质体紫外诱变处理,经过初筛和复筛,获得了生长速度、菌丝干重和三萜含量明显高于出发菌株的9株诱变株;通过10次PDA斜面继代培养、液体培养以及栽培试验筛选,获得了菌丝干重和三萜含量稳定提高的诱变株UV-3,该菌株在栽培袋中的菌丝生长速率及子实体中三萜含量分别比出发菌株高58.6%和29.4%。SRAP-PCR结果表明,诱变株UV-3与出发菌株相比,DNA指纹图谱发生了明显改变。

石蒜SRAP-PCR扩增体系的建立与优化

以陕西产野生石蒜〔Lycorisradiata (L’Hr.)Herb.〕为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度及Taq DNA聚合酶用量对石蒜SRAP分子标记扩增体系的影响,并对扩增体系进行了优化。优化后的反应体系总体积为10μL,含20ng模板DNA、3.0mmol·L-1Mg2+、0.20mmol·L-1dNTPs、0.4μmol·L-1引物和0.50UTaq DNA聚合酶。运用优化体系对9个石蒜居群的基因组DNA进行扩增,获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明SRAP-PCR可用于石蒜属植物的亲缘关系、系统演化、物种鉴别和遗传多样性等领域的研究。

油茶SRAP-PCR反应体系的建立和优化

为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16(45)正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2+2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。

菊花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

采用L16(45)正交实验设计,对SRAP-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs和引物浓度以及TaqDNA聚合酶和模板DNA用量等5个因素进行了优化,并确立了适合菊花〔Dendranthema×grandiflorum (Ramat.) Kitamura〕SRAP-PCR的反应体系。菊花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应体系总体积20μL,含3.125 mmol.L-1Mg2+、187.5μmol.L-1dNTPs、10.0μmol.L-1引物、50 ng模板DNA、0.5 UTaqDNA聚合酶及1×PCR buffer。各因素对菊花基因组DNA SRAP-PCR扩增结果的影响程度不同,其中dNTPs浓度影响最大,TaqDNA聚合酶用量的影响最小。运用菊花品种‘奥运含笑’和‘雨花落英’及二者的F1杂交后代单株的基因组DNA对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明所确立的菊花SRAP-PCR反应体系稳定可靠。

应用SRAP标记对茄子品种进行遗传多样性分析与指纹图谱构建

利用SRAP技术对36份茄子栽培品种进行了分子鉴定。结果表明:选用25对引物组合对其基因组DNA进行PCR扩增,共获得566条扩增带,其中多态性谱带102条,平均每个引物组合扩增出4.08条多态性条带;品种间‘望哈茄’与‘本溪早紫茄’遗传相似系数最大,为0.986,‘辐射1号’与‘沪紫长茄’间遗传相似系数为0.581。同时使用8对引物组合构建了36个品种的指纹图谱,其中引物FC8ME10可以把‘闽长茄’与其他茄子品种完全区分开。引物SA1OD3可以把‘敦和茄’和‘苏大青茄’同其他茄子品种区分开来。表明:SRAP标记技术能较好地从分子水平揭示出茄子品种的遗传多样性,并能有效应用于茄子品种指纹图谱构建。

东方百合SRAP体系优化及引物筛选

以东方百合商品种‘索蚌’(‘Sorbonne’)和‘康斯坦撒’(‘Constantsa’)及其F1代杂交群体为实验材料,从100对SRAP引物中筛选出59对扩增产物丰富、具有较高多态性的引物,同时对PCR反应体系进行了优化。采用正交设计,对Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶及引物浓度进行4因素4水平优化,并在此基础上对Mg2+、引物浓度和退火温度进行了单因素优化。结果表明,东方百合SRAP的最佳体系为:1×Buffer,Mg2+浓度2.7 mmol/L,dNTPs浓度0.25 mmol/L,引物浓度0.8μmol/L,Taq聚合酶1.5μmol/min,模板DNA 60～100 ng。SRAP两步反应最佳退火温度为第1步35℃,第2步退火59.3℃。最后用‘索蚌’、‘康斯坦撒’和部分F1植株对优化体系进行稳定性检测,发现所筛选出的59对引物在优化的体系下均有稳定的扩增产物。

蓝莓SRAP—PCR反应体系的建立优化及引物筛选

为进一步利用分子标记技术进行蓝莓品种鉴定及种质资源遗传多样性的分析,拟建立蓝莓新型SRAP标记(相关序列扩增多态性)的优化PCR体系并进行引物组合的筛选。运用改良CTAB法所提取的蓝莓幼嫩叶片的DNA,采用单因子试验,分析了模板DNA浓度、引物浓度、退火温度等影响SRAP-PCR的主要参数,建立了适合蓝莓SRAP-PCR的优化体系,20μL的PCR反应体系:模板DNA浓度120 ng、引物浓度0.40μmol/L、2×TaqPCR Master Mix 10μL,剩余体积用去离子水补足;最佳PCR扩增程序的退火温度为50℃。并从80对SRAP引物组合中筛选出条带清晰且多态性丰富的15对引物组合。

苹果SRAP-PCR反应体系的建立

以苹果(Malus domestica Borkh.)品种Telamon及Telamon×Fuji的F1代为试材,采用改良的CTAB法提取苹果叶片的DNA,利用正交设计L16(45)和直观分析以及方差分析相结合,探讨了Mg2+、dNTPs、Primer、Taq聚合酶、模板DNA用量对苹果SRAP-PCR反应的影响。建立了总体积为10μL的苹果SRAP-PCR反应体系,Mg2+浓度为2.0mmol.L-1,dNTPs浓度为0.8 mmol.L-1,Primer浓度为0.2μmol.L-1,Taq DNA聚合酶含量为0.6 U,DNA含量为60 ng,并含1μL 10×buffer(Mg2+free)。应用该反应体系,用不同的引物组合对48份苹果样品DNA进行SRAP-PCR扩增,结果显示反应体系具有较高的稳定性。

用SRAP标记鉴定落羽杉属植物杂种

In this paper,the authenticity of 4 reciprocal progenies from Taxodium distichum and T.mucronatum was identified by SRAP(Sequence-related Amplified Polymorphism) markers.Firstly,48 SRAP primer combinations were randomly selected and polymorphism primers between two parents(T.distichum and T.mucronatum) were selected.As a result,all primers amplifid clear bands,and 29 primers had polymorphism bands of two parents,accounted for 60.4% of all primers,and 14 primer combinations with specific bands both two samples.Authenticity of 4 progenies from T.distichum and T.mucronatum was identified by 12 polymorphism primer combinations selected from above 29 polymorphism primer combinations.The results showed that 4 progenies were all identified to be true hybrids owing to their specific bands from male parent.Among the primer combinations,Me9+Em10 produced specific bands of both male parent and female parent in every progeny,that is to say,with this one primer combination alone,the status of 4 progenies can be identified.Efficiency of molecule identification were much improved.The results of hybrids identification provided a solid evidence for the hybrids further study and application.The experimental results also proved that SRAP molecular marker technology can be effectively applied in the researches on Taxodium.

油茶SRAP标记的PCR体系建立与优化

油茶是我国主要的木本食用油料树种,拟建立油茶新型SRAP标记(序列相关扩增多态性)的优化PCR体系。以油茶优良品种的总DNA为材料,分析了影响油茶SRAP-PCR的主要参数,包括模板DNA量、引物浓度、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、退火温度6个因素的影响,建立了适合油茶SRAP-PCR的优化体系为:20μL的PCR反应体系中,2.0μL 10×PCR buffer,2.0 mmol/L Mg2+,225μmol/L dNTPs,0.6μmol/L引物,30 ng模板DNA和0.75 U Taq DNA聚合酶;最佳PCR循环条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5循环;94℃变性1 min,52℃复性1 min,72℃延伸1 min,35循环;最后72℃延伸10 min;4℃保存。本研究结果可为今后利用SRAP这一新型标记技术进行油茶分子遗传学与标记辅助选择育种研究打下基础。

百里香属植物ISSR-PCR和SRAP-PCR体系的确立及优化

通过对PCR扩增体系中的模板DNA用量,Mg2+、dNTPs和引物浓度的单因子实验,分别建立了适合百里香属(ThymusL.)植物总DNA的ISSR-PCR及SRAP-PCR优化反应体系。ISSR-PCR优化反应体系为:反应总体积20μL,含模板DNA 30 ng、Mg2+3.75 mmol.L-1、dNTPs 0.20 mmol.L-1、引物0.3 mmol.L-1和TaqDNA聚合酶1 U。SRAP-PCR优化反应体系为:反应总体积20μL,含模板DNA 30 ng、Mg2+2.50 mmol.L-1、dNTPs 0.10mmol.L-1、引物0.4 mmol.L-1和TaqDNA聚合酶1 U。运用优化的反应体系对百里香属植物地椒(T.quinque-costatusCelak.)、地椒的亚洲变种〔T.quinquecostatusvar.asiaticus(K itagawa)C.Y.W u etY.C.Huang〕和百里香(T.m ongolicusRonn.)15个居群的总DNA进行了ISSR和SRAP初步分析,获得了较好的扩增结果。

荔枝SRAP-PCR反应体系的优化

SRAP(sequence-related amplified polymorphism)是基于基因的内含子和外显子区域进行检测的新型分子标记技术,具有多态性高、重复性好、易测序、便于克隆目标片段等特点,在荔枝(Litchi chinensis Sonn)中还没有相关的研究报道。为了建立适合荔枝的SRAP反应体系,对反应体系中的DNA模板、Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶诸因子的用量进行了探索,确立了适合荔枝的SRAP反应体系为:在20μL反应体系中,模板DNA为40ng,Mg2+浓度2.5mmol/L,dNTP0.3mmol/L,引物5mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U。扩增程序为:94℃预变性3min,反应前5个循环在94℃ 1 min、35℃ 1 min、72℃ 1 min的条件下运行;随后的35个循环退火温度提高到50℃;最后72℃延伸10min。利用该反应体系对荔枝10个不同品系进行SRAP反应,用5%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果显示:不同品系间DNA谱带多态性丰富。证实该体系稳定可靠,可以用于荔枝的分子标记研究。

荷花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

以荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)品种‘新红’叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化,并确立了适用于荷花SRAP-PCR的最佳反应体系。结果表明:荷花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应总体积10μL,包含2.0 mmol.L-1 Mg2+、300μmol.L-1 dNTPs、0.5 UTaqDNA聚合酶、4μmol.L-1上下游引物、50 ng DNA及10×PCR Buffer。各因素水平变化对反应体系影响由大到小依次为:TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、DNA。用48个荷花品种对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定性和适应性。

白木香SRAP-PCR反应体系的建立

本实验对白木香SRAP-PCR反应体系的影响因素(模板DNA,Taq酶,Mg2+,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立白木香SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL):模板DNA50ng、引物0.30μmol/L、Mg2+1.5mmol/L、dNTP0.4mmol/L和Taq DNA聚合酶1.0U。适用于白木香的SRAP-PCR反应体系迄今未见报道,这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对白木香进行基础研究提供了一个标准化的程序。

非洲菊SRAP标记的DNA模板制备及反应体系优化

为获得非洲菊清晰的SRAP标记图谱,对非洲菊DNA的提取方法及其SRAP-PCR反应体系的影响因子进行了初步探讨,建立了扩增多态性高、重复性好、带型清晰的DNA模板和SRAP-PCR反应体系.最佳SPAR-PCR反应体系:在50μL的反应总体系中,Mg2+2.0mmol/L,dNTPs0.3mmol/L,DNA模板100ng,DNA聚合酶2.0U,上游、下游引物各0.22mmol/L.扩增程序:在94℃预变性4min,反应前5个循环在94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min的条件下运行,随后的30个循环复性温度提高到55℃,最后72℃延伸5min.

苦楝SRAP-PCR反应体系的建立及优化

【目的】应用SRAP技术对苦楝Melia azedarach遗传多样性、种质资源鉴定等开展研究，对苦楝SRAP-PCR体系中的模板DNA、dNTPs、Mg^2＋、引物和TaqDNA聚合酶5个组分浓度进行优化，建立适合苦楝的SRAP-PCR反应体系．【方法】采用单因素试验对反应体系中的5个因素分别设置8个浓度梯度水平，确定浓度范围后进行L16（4^5）正交试验设计，并对结果进行打分，确定优化体系．【结果和结论】SRAP对苦楝DNA浓度的要求不高，有一个较宽的浓度适宜范围；dNTPs在0．1～0．2mmol·L^-1范围内，能扩增出条带基本相同的清晰谱带；Mg^2＋为2．0mmol·L^-1左右时扩增条带较清晰且数量多；引物介于0．48～0．64μmol·L^-1均能扩增出带型基本保持一致且清晰的谱带；TaqDNA聚合酶在0．50～2．00U范围内可以得到清晰的带型．根据正交试验设计16个处理的得分，确定优化的反应体系为：模板DNA 30ng、dNTPs0．125mmol·L^-1、Mg^2＋ 2．25mmol·L^-1、引物0．48μmol·L^-1、TaqDNA聚合酶0．75U，反应总体积25μL．

野生濒危掌叶木SRAP-PCR体系的建立与优化

以野生濒危植物掌叶木的叶片为材料,通过正交试验与单因素试验相结合的方法,研究了模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度等因素对SRAP-PCR反应的影响,建立了适宜于掌叶木SRAP分析的扩增体系,即20μL的反应体系中含模板DNA约20 ng,Mg2+2.0 mmol/L,引物0.6μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U。该研究为利用SRAP技术分析掌叶木遗传多样性、进行掌叶木种质资源相关研究等奠定了良好的基础。

5种温带果树SRAP-PCR退火温度的优化

SRAP技术是一种多态性和信息量丰富的新型分子标记技术,近年来在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建以及比较基因组学研究等方面得到广泛应用。有关SRAP-PCR反应体系的优化很少涉及到退火温度。因此,我们利用梯度PCR技术,对SRAP-PCR过程中的两步退火温度进行了研究,以期获得较好的退火温度组合。通过对第一步前5轮循环的退火温度梯度37～50℃的实验,其退火温度可提高到41℃;对第二步后30轮循环的退火温度梯度50～60℃的实验,其退火温度可提高到52℃。应用该程序在苹果、桃、板栗、梨和樱桃等5个树种各4个品种进行扩增,均获得了良好的结果。