辣椒SRAP-PCR反应体系的建立与优化

SRAP标记(Sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)是由Li和Quiros发展了一种新的分子标记技术。SRAP标记具有简便、稳定、中等产率、在基因组中分布均匀的特点,已经应用于在水稻、棉花、油菜、马铃薯、苹果、柑橘类果树、樱桃、梅子、大蒜、莴苣及芹菜等植物和水稻稻瘟病的研究中,对开展遗传图谱构建、基因定位与克隆、比较基因组学、cDNA指纹图谱、生物多样性研究、预测杂种优势等研究是一个十分实用的工具。本研究对辣椒SRAP反应体系的程序、模板、Mg2+等参数进行优化研究,结果表明:辣椒的PCR程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5循环,94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,35循环,最后72℃延伸10min;25滋l反应体系中,模板量为15ng,Mg2+为2.0mmol/L。本研究建立的辣椒SRAP体系重复性好、稳定性强。

菊花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

采用L16(45)正交实验设计,对SRAP-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs和引物浓度以及TaqDNA聚合酶和模板DNA用量等5个因素进行了优化,并确立了适合菊花〔Dendranthema×grandiflorum (Ramat.) Kitamura〕SRAP-PCR的反应体系。菊花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应体系总体积20μL,含3.125 mmol.L-1Mg2+、187.5μmol.L-1dNTPs、10.0μmol.L-1引物、50 ng模板DNA、0.5 UTaqDNA聚合酶及1×PCR buffer。各因素对菊花基因组DNA SRAP-PCR扩增结果的影响程度不同,其中dNTPs浓度影响最大,TaqDNA聚合酶用量的影响最小。运用菊花品种‘奥运含笑’和‘雨花落英’及二者的F1杂交后代单株的基因组DNA对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明所确立的菊花SRAP-PCR反应体系稳定可靠。

油茶SRAP-PCR反应体系的建立和优化

为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16(45)正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2+2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。

苹果SRAP-PCR反应体系的建立

以苹果(Malus domestica Borkh.)品种Telamon及Telamon×Fuji的F1代为试材,采用改良的CTAB法提取苹果叶片的DNA,利用正交设计L16(45)和直观分析以及方差分析相结合,探讨了Mg2+、dNTPs、Primer、Taq聚合酶、模板DNA用量对苹果SRAP-PCR反应的影响。建立了总体积为10μL的苹果SRAP-PCR反应体系,Mg2+浓度为2.0mmol.L-1,dNTPs浓度为0.8 mmol.L-1,Primer浓度为0.2μmol.L-1,Taq DNA聚合酶含量为0.6 U,DNA含量为60 ng,并含1μL 10×buffer(Mg2+free)。应用该反应体系,用不同的引物组合对48份苹果样品DNA进行SRAP-PCR扩增,结果显示反应体系具有较高的稳定性。

荷花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

以荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)品种‘新红’叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化,并确立了适用于荷花SRAP-PCR的最佳反应体系。结果表明:荷花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应总体积10μL,包含2.0 mmol.L-1 Mg2+、300μmol.L-1 dNTPs、0.5 UTaqDNA聚合酶、4μmol.L-1上下游引物、50 ng DNA及10×PCR Buffer。各因素水平变化对反应体系影响由大到小依次为:TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、DNA。用48个荷花品种对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定性和适应性。

白木香SRAP-PCR反应体系的建立

本实验对白木香SRAP-PCR反应体系的影响因素(模板DNA,Taq酶,Mg2+,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立白木香SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL):模板DNA50ng、引物0.30μmol/L、Mg2+1.5mmol/L、dNTP0.4mmol/L和Taq DNA聚合酶1.0U。适用于白木香的SRAP-PCR反应体系迄今未见报道,这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对白木香进行基础研究提供了一个标准化的程序。

荔枝SRAP-PCR反应体系的优化

SRAP(sequence-related amplified polymorphism)是基于基因的内含子和外显子区域进行检测的新型分子标记技术,具有多态性高、重复性好、易测序、便于克隆目标片段等特点,在荔枝(Litchi chinensis Sonn)中还没有相关的研究报道。为了建立适合荔枝的SRAP反应体系,对反应体系中的DNA模板、Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶诸因子的用量进行了探索,确立了适合荔枝的SRAP反应体系为:在20μL反应体系中,模板DNA为40ng,Mg2+浓度2.5mmol/L,dNTP0.3mmol/L,引物5mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U。扩增程序为:94℃预变性3min,反应前5个循环在94℃ 1 min、35℃ 1 min、72℃ 1 min的条件下运行;随后的35个循环退火温度提高到50℃;最后72℃延伸10min。利用该反应体系对荔枝10个不同品系进行SRAP反应,用5%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果显示:不同品系间DNA谱带多态性丰富。证实该体系稳定可靠,可以用于荔枝的分子标记研究。

苦楝SRAP-PCR反应体系的建立及优化

【目的】应用SRAP技术对苦楝Melia azedarach遗传多样性、种质资源鉴定等开展研究，对苦楝SRAP-PCR体系中的模板DNA、dNTPs、Mg^2＋、引物和TaqDNA聚合酶5个组分浓度进行优化，建立适合苦楝的SRAP-PCR反应体系．【方法】采用单因素试验对反应体系中的5个因素分别设置8个浓度梯度水平，确定浓度范围后进行L16（4^5）正交试验设计，并对结果进行打分，确定优化体系．【结果和结论】SRAP对苦楝DNA浓度的要求不高，有一个较宽的浓度适宜范围；dNTPs在0．1～0．2mmol·L^-1范围内，能扩增出条带基本相同的清晰谱带；Mg^2＋为2．0mmol·L^-1左右时扩增条带较清晰且数量多；引物介于0．48～0．64μmol·L^-1均能扩增出带型基本保持一致且清晰的谱带；TaqDNA聚合酶在0．50～2．00U范围内可以得到清晰的带型．根据正交试验设计16个处理的得分，确定优化的反应体系为：模板DNA 30ng、dNTPs0．125mmol·L^-1、Mg^2＋ 2．25mmol·L^-1、引物0．48μmol·L^-1、TaqDNA聚合酶0．75U，反应总体积25μL．

仁用杏SRAP-PCR体系的正交设计优化

改良CTAB法提取仁用杏基因组DNA,用于建立SRAP-PCR体系。采用L16(44)正交设计试验,对影响仁用杏SRAP-PCR反应体系的4因素(dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq聚合酶量)4水平进行筛选,PCR结果经统计软件SPSS V13.0分析,并对退火温度进行了摸索,确立了仁用杏SRAP-PCR的优化体系:总体积为20 L,dNTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg2+浓度为2.5mmol/L,引物浓度为0.9μmol/L,Taq聚合酶量为1.5 U,退火温度为52℃。本优化体系为仁用杏资源遗传分析奠定了技术基础。

杉木SRAP-PCR体系优化

为建立杉木SRAP-PCR反应体系,利用L16(45)正交设计对影响杉木SRAP-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA浓度5种因素的4个水平进行优化实验,结合正交直观分析和方差分析,对影响反应较大的Mg2+、dNTPs和引物浓度进行单因素实验,最终确定杉木SRAP-PCR最佳的反应体系为:在20μL的PCR反应体系中,Mg2+浓度为2.25 mmol/L、dNTPs为0.15 mmol/L、引物浓度为0.4μmol/L、Taq酶为1.5μmol/min、模板DNA为60 ng,10×PCR Buffer 2μL,不足部分用双蒸水补充至20μL。PCR反应程序的两步最适退火温度第1步为35℃,第2步为53℃。利用上述反应体系进行杉木PCR扩增,能得到清晰、稳定的条带。

丝瓜SRAP-PCR体系建立与优化

以丝瓜基因组DNA为模板,采用正交试验设计,对SRAP(sequence related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)反应体系中的4种关键因素(dNTPs、Taq酶、引物、模板)进行优化,建立了适合于丝瓜基因组SRAP分子标记的扩增体系:反应总体积10μl,其中含Taq酶1.0U、模板DNA 50.00ng、dNTPs 0.3mmol/L、引物0.30μmol/L。该体系能很好地满足丝瓜基因组SRAP标记的要求,可应用于丝瓜的分子生物学研究。

辣椒SRAP-PCR反应体系主要影响因素的单因素和正交设计优化

SRAP标记是一种新的分子标记技术,建立和优化所研究物种的SRAP反应体系是应用SRAP标记的技术关键。本研究以3个辣椒品种为试验材料,采用单因素试验设计对辣椒SRAP-PCR反应体系的5个主要影响因子(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物浓度)设置8个不同的水平梯度,筛选出比较适宜的Mg2+、dNTP、Primer、Taq酶、模板DNA浓度的范围。在此基础上,进一步采用L16(45)正交设计对辣椒SRAP-PCR反应体系的五因素在四个水平上进行优化实验,得出了如下的优化体系:25μl体系中包含1.5mmol/L的Mg2+、0.2mmol/L的dNTP、0.1μmol/L的单条引物、1U的Taq酶和60ng的模板DNA。经用24个辣椒材料进行扩增验证,该体系检测的结果重复性好,稳定性强。因此,本试验所获得的优化体系适用于辣椒的SRAP分子标记研究。

菜用大黄SRAP-PCR反应体系的优化及验证

为建立菜用大黄最佳的SRAP反应体系,进一步对菜用大黄品种进行遗传多样性分析,以菜用大黄基因组DNA为模板,采用单因素与正交设计相结合的方法,对SRAP-PCR扩增体系中的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶浓度5个因素进行优化,并确立菜用大黄SRAP-PCR的最佳体系。结果表明:菜用大黄各因素对反应体系影响大小依次为:引物浓度>Mg2+浓度>dNTPs浓度>Taq DNA聚合酶浓度>DNA用量;最佳反应体系为:25μL反应体系中含10×PCR Buffer 2.50μL、模板DNA 30 ng、Mg2+2.50 mmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.04 U/μL、上下游引物各0.5μmol/L。用8个菜用大黄品种DNA样品对优化的反应体系进行验证,均获得了条带清晰且多态性较好的扩增图谱,证实了该体系的稳定性和可靠性,可用于菜用大黄的遗传多样性分析。

均匀设计优化野生狗牙根的SRAP-PCR反应体系

采用均匀设计方法,对影响野生狗牙根SRAP-PCR体系的MgCl2、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶和模板浓度等进行了U16(45)和U12(35)两轮优化,建立了适用于野生狗牙根的SRAP-PCR反应体系。该优化的25μl反应体系包含MgCl23.5mmol/L,dNTPs0.20nmol/L,引物0.44μmol/L,Taq DNA聚合酶1.50U,模板28ng/L。在此基础上又对退火温度进行了摸索,结果发现扩增结果对退火温度变化不敏感。最后运用优化体系对来自不同地区的10份野生狗牙根的16个单株的DNA进行扩增验证,结果获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明该优化的SRAP-PCR体系可用于野生狗牙根不同种间亲缘关系、系统进化和遗传多样性等领域的研究。

中国兰SRAP-PCR体系的建立及优化

序列相关扩增多态性(SRAP)是新一代的分子标记技术,尚未在兰花中应用过。本实验运用改进了的CTAB法提取国兰总DNA,并L16(45)正交设计,对影响中国兰PCR反应的4个因素(引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、扩增模版)在4个水平上进行优化试验,结果采用DPS软件分析。结果表明,在25μl总体积中,Taq酶为1个单位的情况下,中国兰SRAP-PCR反应最佳扩增体系为:Mg2+2 mmol.L-1、DNA模版100μg、dNTPs 0.25 mmol.L-1、引物0.3μmol.L-1。这一优化的SRAP-PCR体系的建立为后续国兰SRAP分析奠定基础。

无患子SRAP-PCR反应体系的优化

建立适合无患子Sapindus mukurossi的相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应(SRAP-PCR)最佳反应体系,为研究无患子种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良等奠定基础。以南平产的无患子叶片为材料,采用单因素法对体系中的DNA模板、镁离子、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs),引物和TaqDNA聚合酶等5因素进行优化。确立了适合无患子SRAP的最佳反应体系(20μL):1×PCR缓冲液,50 ng模板DNA,2.0 mmol·L-1镁离子,0.2 mmol·L-1dNTPs,0.5×16.67 nkat(0.5 U)TaqDNA聚合酶,0.4μmol·L-1引物。利用该体系对12份无患子种源材料进行PCR扩增,获得了清晰、稳定的DNA谱带,说明优化后的体系适宜无患子地理种源的遗传多样性分析。

正交设计优化日本落叶松SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对日本落叶松SRAP-PCR反应体系的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶浓度五因素在四个水平上进行优化试验,PCR结果采用统计软件SPSS13.0进行分析,结果表明:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中模板DNA影响最大;筛选得到日本落叶松SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为模板DNA浓度为120ng.20μL-1,dNTPs的浓度为0.15mmol·L-1,引物浓度为0.3μmol·L-1,Mg2+浓度为1.5mmol·L-1,Taq酶浓度为0.5U.20μL-1。这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对日本落叶松遗传多样性的研究奠定基础。

马铃薯SRAP-PCR反应体系优化及验证

为建立马铃薯最佳的SRAP-PCR反应体系,以马铃薯基因组DNA为模板,采用单因素和正交试验相结合的方法,对影响SRAP-PCR反应体系的5个因素(引物浓度、Mg2+浓度、模板DNA用量、d NTPs浓度和Taq DNA聚合酶用量)进行优化,建立马铃薯优化的SRAP-PCR反应体系。结果表明:马铃薯SRAP-PCR最佳反应体系中模板DNA用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为0.75 U。各因素对扩增结果影响依次是:Mg2+浓度>Taq DNA聚合酶用量>模板DNA用量>引物浓度>d NTPs浓度。用6份马铃薯样品DNA对优化体系进行验证,扩增结果清晰稳定,可用于马铃薯遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究。

狗牙根SRAP-PCR反应体系的优化

本研究以狗牙根幼叶为为试材,采用单因子试验和正交设计试验2种方法,对SRAP-PCR反应体系进行优化试验,结果表明狗牙根25μLSRAP-PCR最佳反应体系为:1.5mmol/LMg2+、0.25mmol/LdNTP、0.4μmol/L引物、1.5UTaq酶和80ng模板DNA,最佳退火温度为50.6℃。运用该体系对30份狗牙根种质进行验证,电泳结果显示扩增条带清晰、多态性高,证明该体系稳定可靠,这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对狗牙根进行分子生物学研究提供了帮助。

蓝莓SRAP-PCR反应体系的建立和优化及其遗传多样性分析

以9个品种蓝莓为试材，采用L16（4^5）正交实验设计建立和优化了蓝莓SRAP-PCR反应体系，并利用该体系分析了供试蓝莓品种之间的遗传多样性。结果表明：蓝莓SRAP—PCR反应的最佳体系（20μL）为：MgCl22．5mmol／L、dNTPs100μmol／L、TaqDNA聚合酶0．8U、引物0．2t~mol／L、DNA40ng、1×ReactionBuffer；9个品种蓝莓的遗传相似性系数分布于0．1818-1．0000之间，平均遗传相似性系数为0．6359，存在较高的遗传多样性。基于UPGMA的聚类分析将供试材料分成4个类群，主坐标分析同样将供试材料分成4个类群，二者结果一致。