SRSF9基因敲除胶质母细胞瘤细胞株基因回补及其功能研究

目的在CRISPR/Cas9敲除SRSF9基因的胶质母细胞瘤U87单克隆株中进行SRSF9基因回补并进行回补功能研究。方法构建SRSF9-WT过表达载体并同义突变sgRNA1靶序列上的5个碱基构建SRSF9-sgMu过表达载体并包装成慢病毒,感染U87 SRSF9基因敲除单克隆细胞,构建SRSF9基因回补细胞株。利用Western blot和免疫荧光实验验证回补蛋白的定位,利用增殖和肿瘤干细胞成球实验验证回补基因的拯救功能。结果成功构建SRSF9-WT和SRSF9-sgMu过表达载体并包装成慢病毒。Western blot和免疫荧光实验验证回补成功,且回补的SRSF9蛋白优势表达于细胞核。增殖和肿瘤干细胞成球实验证明回补的SRSF9可以拯救其功能(P<0.05)。结论SRSF9-sgMu成功在SRSF9基因敲除的U87单克隆细胞中回补SRSF9并拯救增殖和肿瘤干细胞成球功能。

基于CRISPR/Cas9技术的SRSF9基因敲除对成胶质细胞瘤生物学功能的影响

目的:基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regulatory interspaced shortpalindromicrepeats,CRISPR)/Cas9系统构建富含丝氨酸/精氨酸剪切因子9(serine-arginine-rich splicing factor 9,SRSF9)基因敲除的人脑胶质瘤U87稳定细胞株,研究SRSF9在人成胶质细胞瘤中的生物学功能。方法:利用CRISPR/Cas9系统构建3个针对SRSF9基因的单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),将其转入胶质瘤U87细胞后,采用蛋白质印迹法鉴定SRSF9基因敲除效率。采用有限稀释法挑选出3株SRSF9基因敲除的U87单克隆细胞株并扩增,采用CCK-8法和EdU掺入的FCM法检测细胞体外增殖能力,采用平板克隆形成实验和干细胞成球实验分别检测细胞体外克隆形成和成球的能力,采用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内成瘤的能力。结果:3条sgRNA成功插入慢病毒载体中,且序列正确。经慢病毒感染效率分析及蛋白质印迹法鉴定证明,SRSF9基因敲除的U87多克隆细胞株构建成功;经蛋白质印迹法和DNA测序确认SRSF9基因敲除的U87单克隆细胞株构建成功,序列发生移码突变。SRSF9基因敲除后,U87单克隆细胞的增殖和克隆形成能力均明显降低(P值均<0.05),肿瘤干细胞成球能力也明显下降(P <0.001),而且在裸鼠体内的成瘤能力明显减弱(P <0.01)。结论:成功建立基于CRISPR/Cas9技术的SRSF9基因敲除的脑胶质瘤U87细胞株,并通过功能实验证明SRSF 9是成胶质细胞瘤的一个关键致癌基因。