细粒棘球绦虫EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9株基因组全长cDNA的构建

试验旨在通过反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9疫苗株,为中国农牧区的狂犬病和包虫病的有效防控提供技术手段。本试验参照狂犬病病毒SRV9株全基因组序列,利用基因合成技术分别合成狂犬病病毒的结构蛋白N、P、L基因,以及N-P-M基因融合片段和狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因与增强型绿色荧光蛋白eGFP融合片段基因,通过载体酶切插入连接方法,依次将狂犬病病毒L基因、N-P-M基因融合片段和G+EgM123+eGFP基因融合片段重组于pcDNA3.1(-)表达载体上,构建EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9全长cDNA。将合成的基因分别构建于pcDNA3.1(-)表达载体,经转化、质粒酶切、基因测序鉴定结果表明,狂犬病病毒N、P、L、N+P+M和G+EgM123+eGFP基因片段长度分别为1365、1107、6471、3160和3256 bp;EgM123基因重组狂犬病病毒全长cDNA片段长度为12465 bp,各基因片段测序结果为100%。本试验成功构建了EgM123基因重组狂犬病病毒全长cDNA片段和狂犬病病毒N、P、L基因的真核表达载体,为通过反向遗传学拯救EgM123基因重组狂犬病病毒及狂犬病和包虫病二联基因重组口服活疫苗的研制提供参考。

狂犬病病毒SRV_9株修饰全长基因组cDNA克隆的构建

为获得狂犬病病毒(rabies virus,RV)SRV9株的基因组全长cDNA克隆并对其进行基因修饰,深入研究狂犬病病毒的基因组特性及构建新型病毒载体,本研究根据GenBank中公布的SRV9基因组序列设计数对引物,以SRV9病毒为材料,从病毒总RNA中将全长基因组11 928 bp分5段扩增,克隆至载体测序鉴定。测序正确后,设计引物缺失基因组Ψ区并在缺失位置插入人细胞色素C基因,又设计引物删除糖蛋白(G)胞质区(CD区)。利用引物在病毒基因组起始处添加锤头状核酶序列,在病毒序列结尾处添加了丁型肝炎核酶序列。再次测序后克隆至pcDNA3.1(+)载体,利用扩增片段自身内切酶位点顺次进行修饰后全长连接,从而获得含修饰SRV9全长基因组的质粒pcDNA3.1-SRV9,为RV感染性克隆的建立奠定了基础。

狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒(Rabies virus,RV)SRV9株糖蛋白(Glycoprotein)基因的重组伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV),并进行鉴定。方法将SRV9株糖蛋白基因表达盒和报告基因Lac Z表达盒克隆至转移载体p8AA中,构建转移质粒p8AA-LacZ-G,与PRV Bartha-K61株基因组共转染BHK-21细胞,待细胞发生病变后,收集病毒液,进行多轮蓝色噬斑筛选,获得重组病毒rPRV-LacZ-G,对其进行电镜观察、PCR及Western blot鉴定,并测定重组病毒的滴度。结果酶切及测序鉴定证实,转移质粒p8AA-LacZ-G构建正确;电镜观察显示,重组病毒rPRV-LacZ-G呈典型的PRV特征结构;PCR分析显示可见RV 1 790 bp的特异性条带;Western blot显示,重组病毒可与SRV9株糖蛋白单抗发生反应,形成特异条带;经测定,重组病毒的滴度为106.25TCID50/ml,较Bartha-K61亲本株的滴度(107TCID50/ml)下降。结论成功构建了RV SRV9株糖蛋白基因重组PRV rPRV-LacZ-G,为其应用于兽用狂犬病疫苗的开发奠定了基础。

狂犬病病毒SRV9株糖蛋白333位氨基酸变异对其免疫原性的影响

目的探讨狂犬病病毒(Rabies virus,RV)SRV9株糖蛋白(G)333位丝氨酸(S)分别突变为精氨酸(R)和谷氨酸(E)后,对其免疫原性的影响。方法采用RT-PCR法扩增RV SRV9株G蛋白基因,经测序鉴定正确后,通过PCR将编码糖蛋白333位丝氨酸的核苷酸分别突变为编码精氨酸和谷氨酸的核苷酸,并分别构建复制缺陷型重组人5型腺病毒rAd5-SRV9-G333E、rAd5-SRV9-G333S和rAd5-SRV9-G333R,经形态学观察、RT-PCR检测及直接免疫荧光试验鉴定重组腺病毒,并免疫小鼠,检测小鼠中和抗体水平及阳转率,评价3种重组腺病毒免疫原性的差异。结果 SRV9株G蛋白基因及其突变体经测序鉴定正确;制备的重组腺病毒镜下可见典型的腺病毒外形特征,感染HEK293AD细胞后出现明显的细胞病变;RT-PCR及直接免疫荧光试验结果显示,3种重组腺病毒在HEK293AD细胞中均已成功表达;rAd5-SRV9-G333E诱导小鼠产生的中和抗体效价和阳转率均明显高于rAd5-SRV9-G333S(P<0.05)。结论 RV SRV9株糖蛋白333位丝氨酸突变为谷氨酸后,可显著增强其免疫原性。

狂犬病无毒疫苗株SRV_9G基因主要功能区的序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出了狂犬病无毒疫苗株（ＳＲＶ９）糖蛋白（Ｇ）基因膜外主要功能区的两个片段，共约７４０个ｂｐ（４５０～１１４４），含有可以诱导中和抗体的两个抗原决定簇和决定毒力及与神经细胞受体结合部位的基因片段。通过平端连接将两片段克隆到ｐＵＣ１８的ＳｍａＩ位点。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。将这一序列与已发表的狂犬病病毒ＳＡＤＢ１９株的相应序列通过计算机进行比较分析。结果证明两者核苷酸序列的同源性为９８．６％，推导氨基酸序列的同源性为９５．９％，主要抗原区内的几个重要氨基酸（如３３３位精氨酸等）发生了变异，糖基化位点也改变。

利用电穿孔法对狂犬病病毒SRV9 Ψ区缺失株病毒的拯救及鉴定

探讨电穿孔转染法对SRV9Ψ区缺失株重组病毒的拯救及鉴定。利用电穿孔细胞转染法,将纯化的Ψ区缺失株pcDNA-NPMG-L全长质粒和pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M、pcDNA-G和pcDNA-L辅助表达质粒共转染至BHK-21细胞中,并进行盲传,借助RT-PCR、间接免疫荧光试验、Western-blot及透射电子显微镜对重组病毒进行鉴定。结果显示,重组病毒能够产生绿色荧光,透射电子显微镜观察可见典型的弹状病毒,对重组毒株与亲本毒株G蛋白进行Western-blot验证,可获得相应目的条带。结果表明,通过电穿孔细胞转染法,能成功拯救出重组病毒SRV9Ψ区缺失株,为病毒的拯救提供新的转染方法,并能有效提高转染效率,为研发新型狂犬病疫苗提供参考。

狂犬病病毒rSRV_9减毒株与亲本SRV_9毒株的病毒毒力比较

通过半数荧光灶形成量(FFD50)试验、小鼠半数致死量(LD50)试验、免疫组织化学试验,对10个培养代次的狂犬病病毒SRV9亲本毒株和rSRV9减毒株的病毒滴度、毒力及其致病性等病毒生物学特性进行检测,以鉴定拯救狂犬病rSRV9减毒株与亲本SRV9毒株病毒滴度及毒力的差异性。试验结果显示,10个培养代次的狂犬病病毒rSRV9减毒株FFD50值为5.44～7.46logFFD50/0.1mL,LD50值为2.47～2.68logLD50/0.03mL;亲本SRV9毒株FFD50值为6.36～6.79logFFD50/0.1mL;LD50值为5.56～5.79logLD50/0.03mL,通过免疫组织化学试验,检测出脑内注射SRV9毒株和rSRV9减毒株死亡小鼠脑神经细胞内的狂犬病病毒。

狂犬病口服疫苗SRV_9毒株基因序列的生物信息学分析

为了解狂犬病口服疫苗SRV9毒株的基因序列与生物学特性的关系,并就其主要抗原位点与国内外现用狂犬病疫苗生产毒株进行比较,明确其作为口服疫苗株的分子基础,本试验通过RT-PCR方法对狂犬病口服疫苗SRV9毒株的N、P、M、G、L基因分别进行克隆,并分别连接于pMD19-T载体,经酶切、测序鉴定后,用DNAStar软件对全基因序列进行分析,并与11株目前生产用狂犬病疫苗株进行基因序列比对分析和主要抗原位点的比较。狂犬病口服疫苗SRV9毒株N、P、M、G、L基因序列与其他毒株的序列同源性为81.8%~100.0%,由全基因组进化树可知,SRV9毒株与所有疫苗株在同一个大的分支内,均属于基因Ⅰ型,其中狂犬病口服疫苗SRV9毒株与ERA、SAD B19、SAG-2等口服疫苗株的进化距离最近,而与疫苗生产毒株aG、RC-HL之间的进化距离则较远。狂犬病口服疫苗SRV9毒株与各疫苗株的糖蛋白不同结构区的氨基酸同源性分析表明,狂犬病口服疫苗SRV9毒株与SAD B19、SAG-2、ERA口服疫苗株的膜外区、跨膜区和膜内区的同源性最高。狂犬病口服疫苗SRV9毒株的基因组结构和抗原基因位点特征均与目前生产用口服疫苗株相似,这为今后狂犬病口服疫苗的研制和通过分子生物学技术构建基因重组弱毒疫苗株的研究提供了试验依据。

狂犬病病毒G蛋白昆虫细胞表达及其生物信息学分析

利用RT-PCR方法从SRV9株细胞毒基因组RNA扩增G蛋白基因,然后将其克隆到p MD18-T载体上,将得到的重组克隆质粒SRV9G-p MD18T进行PCR和测序鉴定。结果表明:克隆的基因全长为1 609 bp,阅读框正确;将此SRV9株G基因亚克隆到供体质粒p Fast Bac Dual后获得了重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual;进而将重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,经2次抗性、蓝白斑筛选及PCR分析后,获得重组穿梭质粒SRV9G-Bacmid;将其转染Sf9细胞48 h后,通过细胞形态学和重组杆状病毒负染电镜观察显示,杆状病毒转染成功;通过Western blot检测显示,Sf9细胞成功表达了SRV9 G蛋白。随后,利用Ex PASy服务器上的在线分析工具和生物信息学分析软件DNAStar对G蛋白的基本性质进行了分析。试验采用昆虫细胞Bac-toBac杆状病毒表达系统,成功表达出G蛋白,并对其进行了生物信息学分析,为蛋白纯化及狂犬病诊断试剂盒的进一步研制奠定了基础。