用不提取核酸PCR扩增孕妇血浆中胎儿游离DNA的SRY和FMR1基因

目的建立一种不提取核酸的孕妇血浆中胎儿游离DNA的检测方法。方法构建不提取核酸PCR法,用巢式PCR扩增Y染色体上的SRY基因序列和X染色体上的FMR1基因序列,检测44例孕妇血浆中游离DNA。根据随访判断结果的准确性。结果 44例孕妇经随访确认24例有男性胎儿,20例有女性胎儿。24例孕男性胎儿的孕妇血浆标本中有21例扩增出SRY基因和FMR1基因,敏感性为87.5%(21/24);20例孕女性胎儿的孕妇血浆标本中有17例扩增出FMR1基因,敏感性为85.0%(17/20)。结论建立的不提取核酸PCR法具有快速、简便等优点,可用于性连锁遗传病的产前诊断。

孕妇血浆中游离胎儿DNA的SRY、DXS8377检测

目的:建立一种孕早期、简便且无创伤性的胎儿性别的产前诊断方法。方法:应用降落PCR和二次PCR扩增技术,联合检测妊娠14～20周的正常孕妇血浆中游离胎儿DNA的SRY基因和DXS8377位点。结果:24例孕妇血浆中游离DNA检测SRY基因和DXS8377位点,明确判断性别22例,不能明确判断性别2例。结论:采用降落PCR和二次PCR扩增技术,联合检测孕妇血浆中游离胎儿DNA,可提高孕早期胎儿性别判断准确率。

母血浆胎儿游离DNA检测SRY基因

【目的】建立一种比较稳定可靠的无创性获取胎儿遗传物质的方法。【方法】从孕妇外周血血浆中提取胎儿游离DNA,以Y染色体上的SRY区域为靶序列进行扩增,扩增产物经DNA测序进行确认,由此来确定我们获得的胎儿DNA。【结果】我们利用获取胎儿游离DNA的方法对16例孕妇进行检测,10例获得了成功,除1例未随访到结果之外,其他9例的随访结果和我们实验判断结果一致。【结论】我们初步建立的这种获得胎儿游离DNA的方法具有可靠性,胎儿游离DNA可以用于性连锁遗传病和单基因疾病的产前诊断。

孕妇血浆中胎儿DNA的SRY基因检测

目的：探索一种孕期、快速、非创伤性的胎儿性别的产前诊断方法。方法：应用DNA—PCR扩增技术，检测妊娠5—40周的正常孕妇游离在血浆内的无细胞胎儿DNA的SRY基因。结果：90例孕妇血浆中游离DNA检则SRY基因阳性结果32例，其中早孕11例，中孕9例，晚孕12例。最后经绒毛、羊水、脐带血和出生胎儿证实均为男性胎儿，符合率为100％。结论：PCR扩增技术，检测游离在孕妇血浆内的无细胞胎儿DNA能在孕期鉴别胎儿性别，尤其是对早期某些选择性遗传性疾病的非创伤性产前诊断意义重大。

用母体外周血中胎儿游离DNA检测胎儿SRY基因的研究

目的探索从孕妇外周血浆中检测胎儿躲y基因的高灵敏性及高准确性方法。方法应用PcR、实时荧光定量PcR、PEP—PcR技术，检测33例妊娠8～14周的正常孕妇血浆中游离胎儿DNA的脓y基因。组织标本躲y基因检测结果作为性别判定的标准。结果33例孕妇血浆标本检测职y基因，普通PcR检出的灵敏性为58．82％，特异性100％。PEP—PCR的灵敏性为88．24％，特异性100％。荧光定量PCR的灵敏性为88．24％，特异性100％。结论PEP—PCR技术和荧光定量PcR技术均可以提高胎儿游离DNA检测的灵敏度及准确性．可用于进一步染色体疾病的无创性产前筛查研究。

绵羊外周血中游离DNA提取及SRY基因检测

【目的】外周血中游离的DNA主要是指存在于血浆/血清等循环系统里的一些小片段DNA,应用在一些疾病的诊断以及非创伤性产前诊断方面。研究三种方法从绵羊外周血浆/血清中分离提取游离DNA,建立高效的外周血游离DNA提取方法,并对SRY基因进行PCR扩增。【方法】利用加热法、酚氯仿法以及试剂盒法对500μL血浆/血清中游离的DNA进行提取。根据游离DNA片段大小的特点分别设计扩增产物大小为168 bp的检测引物和178 bp的SRY基因引物进行普通PCR检测。【结果】利用加热法、酚氯仿法、试剂盒法都提取到了游离的DNA,PCR后通过琼脂糖凝胶电泳检测到了168 bp的目的片段。同时利用PCR扩增到了178 bp的SRY基因目的片段。【结论】不同的提取方法均可有效提取分离绵羊外周血血清和血浆中游离的DNA片段,能够用于SRY基因的检测。

赤麂SRY基因的测序及其与部分偶蹄目动物SRY基因序列的比较

采用人SRY基因的一段保守序列的引物 ,通过PCR在雄性赤麂中扩增出了赤麂SRY基因的特异片段 ,通过DNA斑点杂交证实其扩增产物与人SRY基因有着较高的同源性。将PCR产物克隆到载体 pGEM TVec tor中 ,转化DH5α菌 ,经与人SRY基因探针进行菌落杂交筛选出赤麂SRY基因的阳性克隆 ,并对其进行了测序 .将其序列与基因库中录入的所有偶蹄目动物的SRY基因序列进行同源性比较 ,用UPGMA法构建了其系统进化树 ,从分类和进化上对赤麂SRY基因进行分析。

孕妇血浆中胎儿DNA的检测

从孕妇外周血中分离胎儿细胞一直是遗传病非损伤性产前诊断的主要思路与探索途径。尽管在孕妇外周血中服地细胞的富集，鉴定，和遗传病的非损伤性产前诊断等方面取得了一些重要的进展，但是利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行遗传病非损伤性产前诊断的主要障碍依然是胎儿细胞的富集效率不高，而过高的的母体背景影响检测胎儿特异等位基因。最近发现在孕妇的血浆中存在胎儿DNA，这一发现为非损伤性产前基因诊断开辟了新途径。我们结合煮沸法与硅法，建立了一种有效的，简便的，经济的从血浆中提取DNA的方法，通过调整PCR系统组成，增加循环次数，成功地从母体血浆中扩增出胎儿特异的SRY基因，同时采取严格的防污染措施，避免了假阳性或假阴性结果。我们的结果表明，应用我们建立的血浆DNA提取方法与调整的PCR系统，在孕早期可以准确地确定胎儿的性别，这对于性连锁疾病的非损伤性产前诊断具有重要意义。我们的工作为我国非损伤性产前诊断研究的开展与深入打下基础。

应用巢式PCR扩增孕妇血浆中胎儿SRY基因的研究

目的:建立一种巢式聚合酶链反应(PCR),利用孕妇血浆中的游离胎儿DNA(fetal DNA)鉴定胎儿SRY基因。方法:随机采集30例孕妇外周血标本,采用酚/氯仿法从孕妇血浆中提取DNA,设计两对引物对SRY基因进行巢式PCR扩增,扩增产物经测序加以确认。结果:17例孕男胎的孕妇血浆中有15例经巢式PCR扩增检出SRY基因,而13例孕女胎的孕妇血浆没有检出阳性结果。准确性和敏感性分别为93.3%(28/30)和88.2%(15/17)。结论:应用酚/氯仿法从孕妇血浆中提取游离DNA简单有效,结合巢式PCR扩增SRY基因技术可用于无创性产前性连锁遗传性疾病的诊断。

应用母体外周血中游离DNA鉴定细毛羊胎儿性别研究

本研究针对不同妊娠时期细毛羊进行胎儿性别鉴定工作。首先对外周血浆/血清分别采用加热法和酚-氯仿法提取游离DNA。通过普通PCR扩增雄性性别决定基因(sex determining region Y,SRY)和β-actin检测基因的目的片段。鉴于部分样品未扩增出SRY基因目的片段,设计2对内外引物,运用优化后的巢式PCR体系再次针对SRY目的基因展开特异性扩增。最后对每个妊娠时间段的鉴定结果和实际生产结果进行统计,计算准确率。结果表明:加热法和酚-氯仿法均成功分离提取出妊娠母羊外周血浆/血清中的游离DNA,并扩增出β-actin检测基因片段;SRY阳性样本扩增出了SRY目的基因片段和β-actin检测基因片段,SRY阴性样本只扩增出了β-actin检测基因片段;性别鉴定的平均准确率达到81.25%(19.5/24),SRY基因检出率与妊娠时间的长短呈正比。结论,本研究建立了一种基于外周血游离DNA检测细毛羊胎儿性别的非创伤性且高效低廉的产前诊断技术,但性别鉴定的准确率还有待提高。

中国人SRY基因的分离、克隆和核苷酸序列分析

睾丸决定因子基因(Testis-determining factor,TDF)位于Y染色体短臂上,它的表达产物诱导睾丸组织的发生。SRY基因(Sex-determining Region of the Y)位于Y染色体的性别决定区内,许多特征显示SRY就是TDF。我们选用与SRY基因相应的引物,用PCR技术对正常人男女各10例的基因组DNA进行扩增。将特异扩增的男性SRY基因片段重组到质粒PUC12中,得到含有中国人SRY基因片段的克隆,命名为PSY-1、PSY-2。用[^(32)p]标记重组质粒中的SRY基因片段作探针,与PCR结果进行Southern杂交,男性样品均显示特异杂交带,女性样品为阴性。用末端终止法测定克隆的SRY基因片段的全部核苷酸序列为299bp,含有SRY基因中高度保守及功能特异性区域的240bp,我们对此进行了讨论。

50例性分化发育不良患者的SRY基因分析

目的 探讨性分化发育不良患者SRY基因的作用及其临床意义。方法 选择在我院遗传室咨询的性分化发育不良患者 5 0例 ,在染色体核型分析的基础上 ,应用聚合酶链 (PCR)技术对每例患者检测SRY基因 ,应用DNA序列分析技术对 6例性染色体XX或XY而SRY(+)的女性患者和 2例染色体为 4 6 ,XY、SRY(+)睾丸发育不良的男性患者 ,进行了SRY基因序列分析。结果 (1) 1例 4 6 ,XX女性SRY(+) ,1例 4 6 ,XX男性SRY(- ) ,1例 4 6 ,XX/ 4 6 ,XY女性和 1例核型为 4 7,XXY男性SRY(+) ,在 4 6 ,XY患者中女性 11例 ,男性 6例SRY(+)。 (2 ) 1例 4 6 ,XX女性SRY基因存在点突变 ,1例 4 6 ,XY女性患者SRY基因序列存在点突变和移码突变。结论 对性分化发育不良患者进行SRY检测及其基因分析 ,不仅有利于为该类患者寻找病因 ,而且有利于指导治疗。

Sry基因监测腺病毒介导肝细胞生长因子修饰的骨髓间充质干细胞移植在大鼠烫伤创面愈合中的作用

目的制备地高辛标记的Sry探针，监测局部异体移植携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒（Ad—HGF）修饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）在烫伤创面愈合中的作用。方法用雄性大鼠肝组织通过聚合酶链反应法克隆Sry基因，并将其构建至TEasyVector上，用地高辛标记法制备Sry基因原位杂交探针。密度梯度离心法体外分离培养雄性Wistar大鼠BMSCs，并转染Ad-HGF。复制16只背部深Ⅱ度烫伤雌性大鼠模型，于造模成功后，将Ad-HGF修饰的BMSCs一次性多点注射于创面真皮下。21d后，处死大鼠，取愈合创面新生组织和正常组织制作石蜡切片，原位杂交法检测组织切片中Sty基因的表达。结果①从8只雄性大鼠中成功克隆出Sry基因；②制备出地高辛标记的Sry探针；③16只雌性大鼠深Ⅱ度烧伤模型复制成功，用Ad-HGF修饰的BMSCs治疗后，原位杂交法证实全部雌鼠创面新生组织中有Sry表达，而正常组织中未检测到。结论外源移植的BMSCs参与了大鼠烫伤创面的修复，Sry基因可作为细胞追踪标记，为细胞治疗追踪技术及利用BMSCs治疗创伤的研究提供依据。

QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA方法的建立

目的:建立QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA的方法,并探讨其方法的稳定性、灵敏性与可靠性。方法:通过prime5.0设计出SRY与β-globin的TapMan探针,并对其QPCR反应体系进行优化。结果:分别得到了SRY与β-globin的引物及探针的反应最适浓度比,建立了其最佳QPCR反应体系,并得出所需外周血的最少量。结论:成功建立了QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA的方法,该方法将可用于无创性相关产前诊断。

PCR-DIG探针斑点杂交法快速检测SRY基因

以正常男性ＤＮＡ作为模板，用本文设计的ＳＲＹ基因的１对引物组合进行ＰＣＲ法制备ＤＩＧ探针，然后通过低熔点琼脂糖电泳回收将扩增产物纯化，得到ＳＲＹ基因探针。与其他制备探针的方法相比，此方法制得的探针产量和标记效率都很高，标记灵敏度达００１ｐｇ，片段长度均一，为２９０ｂｐ。在ＤＮＡ斑点杂交检测ＳＲＹ基因时显示了很好的特异性，显示这种方法可以同时对大量性反转病例进行临床检测。

孕妇血浆中胎儿DNA的定量检测

目的: 定量检测孕妇血浆中游离胎儿DNA含量。方法: 以SRY基因序列作为胎儿DNA的基因标志, 应用实时定量PCR技术测定不同孕期的孕妇血浆中胎儿DNA的含量。结果: ①最早检测出孕妇血浆中胎儿DNA的时间为 7-1周; ②早、中、晚孕期孕妇血浆中胎儿DNA浓度平均值分别为 77. 86、95 .43、325 .61copy/ml, 在孕妇血浆总DNA含量中的相对浓度分别为 4 .88%、6 .10%、4. 77%。结论: 在孕妇血浆中可监测到较高浓度胎儿游离DNA, 并且随着孕期的进展, 胎儿DNA含量逐渐增加, 这一结果有助于进一步无创伤性产前基因诊断的研究。

不同妊娠状态下孕妇外周血中游离胎儿DNA定量分析

目的对不同妊娠状态下孕妇外周血中游离胎儿DNA（f DNA）定量分析,确定其平均浓度及临床参考值范围,初步探讨在不同妊娠状态下母血中f DNA的浓度变化,为临床应用提供科学依据。方法从孕妇外周血浆中提取fDNA,用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法检测其中Y性别决定区的SRY基因。结果在正常早期的孕妇组38例血浆标本中有32例检测到SRY基因,其平均浓度149.25拷贝数/ml,参考值范围为33.28-265.22拷贝数/ml;在正常晚期的孕妇组32例血浆标本中全部检测到SRY基因,其平均浓度为212.14拷贝数/ml,参考值范围为142.76-281.52拷贝数/ml;在晚期患有子痫前期的孕妇30例血浆标本中全部检测到SRY基因,其平均浓度为678.70拷贝数/ml,参考值范围为595.01-726.40拷贝数/ml。实验数据用单因素方差分析,组间差异显著性检验用LSD-t检验。妊娠晚期孕妇血浆中f DNA的含量较妊娠早期升高,约为1.4倍,有统计学意义（P〈0.01）;晚期患子痫前期的孕妇血浆f DNA的水平是同期正常对照组的3.9倍,有统计学意义（P〈0.01）。结论1.用FQ-PCR法最早在孕48天孕妇外周血中即可检测到fDNA。2.随着妊娠的进展孕妇血浆中f DNA的含量升高。3.晚期患子痫前期孕妇其血浆f DNA的水平是同期正常对照组的3.9倍,有统计学意义（P〈0.01）。4.f DNA在进行无创伤性产前诊断中有重要价值。

中国人新SRY基因突变类型－Codon76CGC→CCC的发现

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）体外快速扩增６例４６，ＸＹ女性性反转综合征患者的ＳＲＹ基因片段，并用一种简单准确的ＰＣＲ产物直接测序法进行序列分析，发现一种Ｃｏｄｏｎ７６ＣＧＣ→ＣＣＣ的新突变类型，对该直接测序法的关键和应用进行了讨论。

绵羊SRY基因的分子克隆及序列分析

本研究利用常规方法提取绵羊基因组ＤＮＡ，根据人的ＳＲＹ基因核心序列设计合成了一对引物Ｐ１、Ｐ２。用ＰＣＲ技术对公、母绵羊基因组ＤＮＡ进行体外扩增，将所扩增出的公绵羊特异性ＳＲＹ基因片段重组到质粒ＤＮＡｐＵＣ１９的ＳｍａＩ部位并转化到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ中。挑选阳性克隆进行微溶分析，并用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ酶解。鉴定结果表明，插入片段长度与ＰＣＲ扩增带相符，约２０３ｂｐ。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧末端终止法测定绵羊ＳＲＹ基因核心序列的部分序列，结果表明，用ＰＣＲ分离并重组到质粒载体中的绵羊ＳＲＹ基因核心序列部分序列长度为２０３ｂｐ，这与设计完全相符。其中该序列的１５５个ｂｐ与人的ＳＲＹ基因相应序列的同源性为８２．５８％（１２８／１５５）。可见哺乳动物ＳＲＹ基因的核心序列具有高度保守性，种间差异很小。

用于无创产前诊断的SRY基因高灵敏高特异检测方法研究

通过检测母体外周血中胎儿游离DNA(cffDNA)的SRY基因,确定胎儿性别,可评估胎儿性连锁遗传病的发病风险,降低病儿出生率。本研究建立了高灵敏、高特异、闭管检测不易污染的实时荧光PCR偶联核酸侵入反应方法用于SRY基因的检测。通过优化反应体系中的检测探针浓度、FEN1酶用量、Taq酶用量及预扩增退火温度,确定了最佳的反应条件,即检测探针浓度为250 nmol/L、FEN1酶用量为7.5 U、Taq酶用量为0.5 U、预扩增退火温度为67℃。在最佳反应条件下,实现对含量低至4‰(4 copies/μL)的模拟样本的检测,并成功检测两例孕期分别为9周和10周的临床实际样本。结果表明,所建立的方法可用于母体外周血cffDNA的SRY基因检测,为临床开展基于SRY基因的无创产前诊断提供了新方法。