敲减SRY相关高迁移率族盒蛋白9基因下调Wnt/β-连环蛋白信号对气道肉芽组织成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨敲减SRY相关高迁移率族盒蛋白9(SOX9)基因下调Wnt/β-连环蛋白信号对气道肉芽组织成纤维细胞增殖和凋亡的影响。方法应用基因芯片筛选出气道肉芽组织和气道正常黏膜组织差异表达的基因,用R软件进行分析,挑选最显著的差异基因SOX9作为研究对象,并借助逆转录聚合酶链反应技术验证气道肉芽组织及气道正常黏膜组织SOX9的表达。提取气道肉芽组织成纤维细胞,通过构建shRNA-SOX9慢病毒载体转染气道肉芽组织成纤维细胞,稳定感染shRNA-SOX9慢病毒的细胞标记为shRNA-SOX9(shRNA-SOX9组),稳定感染shRNA阴性对照的慢病毒的细胞标记为阴性对照组,无质粒载体加入的细胞设定为空白对照组。利用实时定量逆转录聚合酶链反应、蛋白质印迹法检测细胞内SOX9和Wnt/β-连环蛋白信号通路上下游基因表达情况;使用细胞计数试剂盒8检测成纤维细胞的活力;流式细胞术检测细胞凋亡率,组间做比较。结果SOX9在气道肉芽组织中呈高表达,shRNA-SOX9慢病毒转染气道肉芽组织成纤维细胞后,SOX9和Wnt/β-连环蛋白信号通路相关基因表达均低于阴性对照组和空白对照组;敲减SOX9后,气道肉芽组织成纤维细胞的增殖能力下降,转染24、48、72 h后,shRNA-SOX9组气道肉芽组织成纤维细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。shRNA-SOX9组细胞凋亡率高于空白对照组和阴性对照组[(16.9±2.0)%比(9.1±1.2)%、(10.1±1.8)%],3组间差异有统计学意义(F=3.854,P=0.021)。结论敲减SOX9可以通过调节Wnt/β-连环蛋白信号通路抑制气道肉芽组织成纤维细胞的增殖、促进凋亡。

普鲁卡因通过调节SRY相关高迁移率族盒蛋白9抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡的机制研究

目的探讨普鲁卡因(PCA)通过调节SRY相关高迁移率族盒蛋白9(SOX9)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡的作用机制。方法以不同浓度(0、2.5、5.0、10.0 mmol/L)PCA处理MCF-7细胞,采用MTT法、流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分别检测细胞增殖、凋亡及细胞中SOX9表达情况。采用MTT法和流式细胞术检测转染SOX9 siRNA对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。过表达SOX9联合10.0 mmol/LPCA处理48 h,检测细胞增殖和凋亡情况。结果培养48、72 h时,随着PCA浓度增加,MCF-7细胞光密度(OD)490值逐渐下降(P<0.05)。培养48h,细胞凋亡率随PCA浓度的增加而提高,nRNA及SOX9蛋白水平均随着PCA浓度增加而下降(P<0.05)。si-SOX9组MCF-7细胞中SOX9蛋白表达量及OD490值均低于si-con组,凋亡率高于si-con组(P<0.05)。PCA组MCF-7细胞中SOX9蛋白表达量及OD49。值均低于Control组,凋亡率高于Control组(P<0.05)。PCA+pcDNA-SOX9组MCF-7细胞中SOX9蛋白表达量及OD49。值均高于PCA+pcDNA组,凋亡率低于PCA+pcDNA组(P<0.05)。结论 PCA可通过调控SOX9表达抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,同时促进细胞凋亡。

结直肠癌组织中HMGB2、MAGE-A9、MMR蛋白表达及其临床意义

目的探讨结直肠癌组织中高迁移率族蛋白B2(HMGB2)、黑色素瘤相关抗原-A9(MAGE-A9)、DNA错配修复基因(MMR)蛋白表达情况,以及其在评估患者预后中的临床价值。方法选取52例结直肠癌患者作为研究对象,术中采集所有患者肿瘤标本及癌旁组织标本,检测HMGB2、MAGE-A9、MMR蛋白表达水平,并分析各指标表达情况与病理特征、预后间的关系。结果肿瘤组织内HMGB2、MAGE-A9、MMR阳性表达高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤分期Ⅲ期、分化程度低分化、淋巴结转移患者HMGB2、MAGE-A9、MMR阳性表达率高于Ⅰ期、Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移患者,差异有统计学意义(P<0.05)。随访3年,52例患者存活率为71.15%(37/52);HMGB2阳性组存活率[61.76%(21/34)]低于HMGB2阴性组[88.89%(16/18)],差异有统计学意义(χ^(2)=4.219,P=0.040);MAGE-A9阳性组存活率[58.62%(17/29)]低于MAGE-A9阴性组[86.96%(20/23)],差异有统计学意义(χ^(2)=5.018,P=0.025);MMR阳性组存活率[52.00%(13/25)]低于MMR阴性组[88.89%(24/27)],差异有统计学意义(χ^(2)=8.606,P=0.003)。结论HMGB2、MAGE-A9、MMR在结直肠癌中呈高表达状态,其表达与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移关系密切,且不同表达患者存活率存在较大差异,可作为评估预后的重要指标。

微小RNA-23通过靶向调节SRY相关高迁移率族盒蛋白-5的表达显著抑制脑垂体腺瘤细胞的增殖

目的观察微小RNA（miRNA，miR）乞3靶向调控SRY相关高迁移率族盒蛋白-5（SOX5）的表达及其对脑垂体腺瘤细胞增殖的影响。方法将miR-23mimic及阴性对照（NC）采用Lipofectamine脂质体法转染至脑垂体腺瘤细胞，并记为miR-23mimic组和NC组，以未转染的脑垂体腺瘤细胞作为对照组。转染后，采用实时荧光定量聚合酶链反应（VQ．PCR）法检测各组细胞miR-23和SOX5mRNA的表达量，Westernblot检测各组细胞SOX5的蛋白水平，噻唑蓝（MTI）法检测的各组细胞增殖活性，采用荧光素酶报告实验检测miR-23对SOX5的靶向调控作用，过表达SOX5与miR-23mimic共转染后检测细胞增殖活性。结果FQ-PCR检测结果显示，转染48h后miR-23mimic组的miR-23的表达水平（0．54±0．13）低于对照组（1．00，P=0．001）和NC组（1．03±0．09，P=0．000），差异有统计学意义；miR-23mimic组增殖活性与其余两组比较，转染24、48、72、96h后的脑垂体腺瘤细胞的增殖能力均降低（A24h=0．47±0．04，A48h=0．52±0.05，A72 h=0．54±0．05，A96h=0．55±0．06，与对照组比较，P1=0．036，P2=0．019，P=0．006，P4=0．000）。荧光素酶报告基因实验表明miR-23可靶定结合SOX5mRNA3’端非编码区（3’UTR）。PcDNA-SOX5与miR-23mimic共转染后，经细胞增殖检测显示，过表达SOX5可抵抗miR-23mimic引起的细胞增殖抑制作用。结论miR-23可靶向下调SOX5的表达显著抑制脑垂体腺瘤细胞的增殖。

MMP3与Sox9基因对人椎间盘退变髓核细胞调控作用

目的探讨基质金属蛋白酶3(MMP3)基因与性别决定相关高迁移率簇蛋白盒基因9(Sox9)调控在人椎间盘退变髓核细胞中的作用。方法构建MMP3与Sox9慢病毒表达载体,感染人退变髓核细胞,按照处理方式不同分为4组,分别为空白对照组(A组)、MMP3沉默转染组(B组)、Sox9过表达组(C组)以及MMP3沉默+Sox9过表达共转组(D组),各组髓核细胞置于恒温培养箱中培养,定期换液。72h后,通过荧光定量PCR方法检测转染人退变髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖mRNA的表达,通过Western Blot方法检测转染人退变髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖蛋白的表达。结果 B、C、D组蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白及mRNA表达水平与A组比较明显增高,差异具有显著性(F=84.50~413.09,q=4.57~49.13,P<0.01);D组蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白及mRNA表达水平与B、C组比较,差异具有显著性(q=13.72~30.24,P<0.01)。结论 MMP3基因沉默、Sox9基因过表达可以促进人退变髓核细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原的分泌,延缓椎间盘退变,且二者之间具有协同作用。

SOX9通过Wnt/β-catenin途径驱动非小细胞肺癌A549细胞的上皮-间充质转化

目的:探究SRY相关的高迁移率族盒9(SOX9)通过Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)途径促进非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞上皮-间充质转化(EMT)的机制。方法:将A549细胞分为OE-NC组、OE-SOX9组、OE-SOX9+XAV-939组。其中OESOX9组通过转染SOX9pcDNA质粒上调SOX9的表达水平;OE-SOX9+XAV-939组在转染SOX9pcDNA质粒的同时在培养基中加入β-catenin抑制剂XAV-939(1.0μmol/L)。用qPCR检测SOX9 mRNA表达水平,CCK-8法检测A549细胞增殖能力,划痕愈合实验检测A549细胞迁移能力,Transwell小室实验检测A549细胞的侵袭能力,WB实验检测SOX9、β-catenin、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、γ-连环蛋白(γ-catenin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)表达水平。结果:转染后OE-SOX9组和OE-SOX9+XAV-939组的SOX9 mRNA和蛋白的水平显著高于OE-NC组(均P<0.05),且OE-SOX9组和OE-SOX9+XAV-939组比较无显著差异(P>0.05)。OE-SOX9组细胞增殖、侵袭和迁移能力显著高于OE-NC组,而OE-SOX9+XAV-939组显著低于OE-SOX9组(均P<0.05)。OE-SOX9组β-catenin蛋白水平显著高于OE-NC组,而OE-SOX9+XAV-939组β-catenin蛋白的水平低于OE-SOX9组(均P<0.05)。与OE-NC组比较,OE-SOX9组的上皮细胞表型标志物E-cadherin、γ-catenin水平下调并且间充质细胞表型标志物N-cadherin、vimentin上调,而OE-SOX9+XAV-939组E-cadherin、y-catenin高于OE-SOX9组,且N-cadherin、vimentin低于OE-SOX9组(均P<0.05)。结论:SOX9可通过激活Wnt/β-catenin通路促进NSCLCA549细胞的增殖、迁移和EMT。

胰腺神经内分泌肿瘤和实性假乳头状肿瘤中INSM1和SOX11的表达及意义

目的:探讨胰岛素瘤相关蛋白1(insulinoma associated protein 1,INSM1)和SRY相关高迁移率族盒蛋白11(SRY-related high-mobility group box 11,SOX11)在胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine tumor,PNET)和实性假乳头状肿瘤(solid pseudopapillary neoplasm,SPN)中的表达及意义。方法:采用免疫组织化学方法在56例PNET、42例SPN、16例导管腺癌(ductal adenocarcinoma,DACC)和8例腺泡细胞癌(acinar cell carcinoma,ACC)中检测INSM1、SOX11、Syn、CgA、CD56、β-catenin和CD99,比较INSM1和SOX11的组合与传统标记物(Syn、CgA、CD56、β-catenin和CD99)在诊断和鉴别诊断PNET和SPN中的应用价值。结果:(1)56例PNET中,INSM1表达于肿瘤细胞及胰岛细胞核,其在肿瘤组织中的阳性表达率为91.07%(51/56);42例SPN、16例DACC和8例ACC均未见INSM1的阳性信号。INSM1在PNET中的阳性表达率与SPN、DACC和ACC相比,差异均有统计学意义(P<0.001)。(2)42例SPN中,SOX11的阳性信号位于肿瘤细胞核,其阳性表达率为92.86%(39/42);56例PNET中,SOX11的阳性表达率为8.93%(5/56),其阳性信号位于3例G 1型和2例G 3型PNET;16例DACC、8例ACC及肿瘤旁的正常胰腺组织均未见SOX11阳性信号;SOX11在SPN中的阳性表达率与PNET、DACC和ACC相比,差异均有统计学意义(P<0.001)。(3)INSM1(+)/SOX11(-)免疫表型对PNET的敏感度为85.71%,与CD56(57.14%)相比差异有统计学意义(P=0.001),与Syn(80.36%)和CgA(71.43%)相比差异无统计学意义(P>0.05);其特异度为100.00%,与Syn(42.86%)和CD56(47.62%)相比差异有统计学意义(P<0.001),与CgA(92.86%)相比差异无统计学意义(P>0.05)。INSM1(-)/SOX11(+)免疫表型对SPN的敏感度为92.86%,与β-catenin(90.48%)和CD99(85.71%)相比差异无统计学意义(P>0.05);其特异度为96.43%,与CD99(48.21%)相比差异有统计学意义(P<0.001),与β-catenin(100.00%)相比差异无统计学意义(P>0.05)。(4)在PNET和SPN中,INSM1和SOX11的表达情况与临床病理参数(患者年龄、性别、肿瘤大小、部位、分级及转移)无关(P均>0.05)。结论:在PNET和SPN中,INSM1和SOX11分别呈阳性的表达模式有助于区分两种肿瘤,两者组合在敏感度和特异度方面优于一些传统的免疫组织化学标记物。

牛蒡子苷元基于机械敏感离子通道对软骨细胞转录因子和胶原蛋白表达的影响

目的:基于机械敏感离子通道探讨牛蒡子苷元(ARG)对软骨细胞SRY相关高迁移率族盒蛋白转录因子9(SOX9)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和胶原蛋白表达的影响。方法:分离并培养原代小鼠软骨细胞。将细胞分为空白组(常规培养基)、ARG组(10μmol/L)、瞬时受体电位香草素亚家族4(TRPV4)抑制剂组(GSK2193874,10 nmol/L)、ARG+抑制剂组(10μmol/L ARG+10 nmol/L GSK2193874)和TRPV4激动剂组(GSK1016790A,10 nmol/L),各组给予相应干预。细胞培养24 h后,免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)表达,PCR检测Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和ColⅡ的mRNA表达水平,Western blot检测转录因子SOX9、RUNX2及ColⅠ、ColⅡ的蛋白表达水平。结果:①免疫荧光染色观察显示,与空白组相比,ARG组、抑制剂组和ARG+抑制剂组ColⅡ蛋白表达更显著,而激动剂组较弱。与ARG组或抑制剂组相比,ARG+抑制剂组ColⅡ蛋白表达更显著。②与空白组相比,ARG组、抑制剂组和ARG+抑制剂组ColⅡmRNA表达量显著增高(P<0.05,P<0.01),ColⅠmRNA表达量明显降低(P<0.01),而激动剂组ColⅡmRNA表达量显著降低(P<0.01)。与ARG组相比,抑制剂组和ARG+抑制剂组细胞的ColⅡ和ColⅠ的mRNA表达量均显著增高(P<0.05,P<0.01),而激动剂组ColⅠmRNA表达量增高(P<0.01),ColⅡmRNA表达量降低(P<0.01)。与抑制剂组相比,ARG+抑制剂组ColⅡ和ColⅠ的mRNA表达量均显著增高(P<0.05)。③与空白组相比,ARG组ColⅡ蛋白表达量显著上调(P<0.01),ColⅠ、SOX9和RUNX2蛋白表达量降低(P<0.05,P<0.01);抑制剂组ColⅡ蛋白表达量亦明显增多(P<0.01),ColⅠ和RUNX2蛋白表达量明显降低(P<0.01);ARG+抑制剂组细胞的ColⅡ蛋白表达量显著升高(P<0.01),SOX9蛋白表达量显著降低(P<0.05),ColⅠ和RUNX2蛋白表达无明显变化(P>0.05);激动剂组ColⅡ和SOX9蛋白表达量明显降低(P<0.01),RUNX2蛋白表达量明显增高(P<0.01),ColⅠ蛋白表达量无明显变化(P>0.05)。④与ARG组相比,抑制剂组ColⅡ和ColⅠ蛋白表达量均显著增高(P<0.05,P<0.01);ARG+抑制剂组细胞的ColⅡ、ColⅠ和RUNX2蛋白表达量均明显增高(P<0.01);激动剂组ColⅡ蛋白表达量降低(P<0.01),ColⅠ和RUNX2蛋白表达量升高(P<0.01)。与抑制剂组相比,ARG+抑制剂组细胞的ColⅡ、ColⅠ和RUNX2蛋白表达量均显著增多(P<0.05),SOX9蛋白表达量明显降低(P<0.05)。结论:ARG可上调软骨细胞ColⅡ表达,抑制ColⅠ表达,调节转录因子SOX9和RUNX2,促进软骨细胞分化成熟。其作用与TRPV4抑制剂相似,两者合用对ColⅡ的调控作用更显著。

养胃舒颗粒联合L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒治疗消化性溃疡的临床研究

目的探讨养胃舒颗粒联合L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒治疗消化性溃疡的临床疗效。方法选取2017年3月—2018年3月在渭南市中医医院消化内科进行诊治的96例消化性溃疡患者,根据用药不同分为对照组和治疗组,每组各48例。对照组口服L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒,0.67 g/次,3次/d。治疗组在对照组基础上口服养胃舒颗粒,10 g/次,2次/d。两组均经过4周治疗后进行效果评价。观察两组的临床疗效,比较两组治疗前后HP根除率、症状评分、血清学指标和胃肠激素水平的变化情况。结果治疗后,对照组和治疗组的总有效率分别是81.25%、97.92%,对照组和治疗组的HP清除率分别是72.92%、91.67%,两组总有效率和HP清除率比较差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组溃疡痛评分、腹胀评分、反酸嗳气评分均较治疗前显著降低,同组治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,治疗组溃疡痛评分、腹胀评分、反酸嗳气评分显著低于对照组,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平均显著降低,但VEGF显著升高,同组治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,治疗组MMP-9、HMGB1、TNF-α、IL-6水平显著低于对照组,但血管内皮生长因子(VEGF)显著高于对照组,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。两组血清肾上腺髓质素(AM)、胃泌素(GAS)水平均降低,而降钙素基因相关肽(CGRP)、生长抑素(SS)水平均显著增高,同组治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,治疗组AM、GAS低于对照组,但CGRP、SS高于对照组,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论养胃舒颗粒联合L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒治疗消化性溃疡可有效改善患者临床症状,降低机体炎症反应,改善胃肠激素水平,具有一定的临床推广应用价值。

模拟步行压力下牛蒡子苷元对软骨细胞的保护机制研究

目的:探讨模拟步行压力对软骨细胞的作用及压力负荷下牛蒡子苷元(ARG)对软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)、SRY相关高迁移率族盒蛋白转录因子9(SOX9)、瞬时受体电位香草素亚家族4(TRPV4)、基质金属蛋白酶(MMPs)的影响。方法:分离并培养小鼠原代软骨细胞,制备3D培养软骨细胞水凝胶。将制备的水凝胶分为空白组、模型组、ARG组和抑制剂组。空白组不进行压力干预,使用常规培养基换液。其他3组均给予模拟步行压力(正弦波,1 Hz,20 kPa)干预2 h。压力干预同时,ARG组和抑制剂组分别给予10μmol/L ARG和10 nmol/L TRPV4抑制剂GSK2193874。收集干预后各组水凝胶提取的软骨细胞,免疫荧光染色检测ColⅡ蛋白表达,PCR检测ColⅡ、SOX9、TRPV4、MMP9、MMP13的mRNA表达水平,Western blot检测ColⅡ、SOX9、TRPV4的蛋白表达水平。结果:①免疫荧光染色观察显示,与空白组相比,模型组ColⅡ蛋白表达较少;与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ蛋白表达明显增多。②与空白组相比,模型组ColⅡ、SOX9、TRPV4的mRNA表达量显著降低(P<0.01),MMP9和MMP13的mRNA表达量均显著增高(P<0.01);与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ、SOX9、TRPV4的mRNA表达量显著增高(P<0.01),MMP9和MMP13的mRNA表达量均显著降低(P<0.01)。③与空白组相比,模型组ColⅡ和SOX9蛋白表达水平显著降低(P<0.01),TRPV4蛋白表达无明显变化;与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ和SOX9蛋白表达水平显著增高(P<0.01),TRPV4蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论:模拟步行压力可导致软骨细胞发生趋向于软骨退化的代谢反应。模拟步行压力下,ARG和TRPV4抑制剂对软骨细胞具有保护作用,其机制可能与上调ColⅡ、SOX9表达,抑制TRPV4、MMP9和MMP13的表达有关。