表达人自身抗原SSA/Ro60重组体的构建及鉴定

目的 :构建表达人自身抗原SSA/Ro6 0的重组体 ,为研究自身免疫病中的抗原抗体作用提供物质基础。方法 :采用逆转录 PCR技术克隆自身抗原SSA/Ro6 0cDNA ,定向插入表达载体PGEX 2T ,并经酶切电泳 ,DNA测序鉴定分析。结果 :经鉴定 ,证明成功构建了表达人自身抗原SSA/Ro6 0的重组体。结论 :SSA/Ro6 0表达型重组体可用于自身抗原SSA/Ro6 0的大量生产并用于诊断。

自身抗原60 kd-Ro/SSA序列分析及抗原性预测

抗自身抗原Ｒｏ／ＳＳＡ的自身抗体出现于系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）、干燥综合征（ＳＳ）等自身免疫病患者血清中，可能参与疾病的发病机制。我们已克隆获得６０ｋｄ－Ｒｏ／ＳＳＡ的基因，并在体外培养中得到表达［１］。我们应用蛋白质数据库与序列分析软件程序包，分析...

HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*02基因多态性与抗Ro/SSA抗体阳性pSS易感性的关系分析

目的基于数据库相关数据分析人类白细胞抗原(HLA)-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因多态性与抗Ro/SSA抗体阳性的原发性干燥综合征(pSS)易感性的关系。方法使用计算机检索相关数据库,筛选并收集pSS患者、抗Ro/SSA抗体阳性的pSS患者、抗Ro/SSA抗体阴性的pSS患者以及健康对照人群的HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*02基因多态性资料。使用STATA 16.0(USA)统计软件分析抗Ro/SSA抗体阳性的pSS患者中HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因多态性与pSS发生的关系。结果纳入文献5篇,涉及420例pSS患者、250例抗Ro/SSA抗体阳性pSS患者、120例抗Ro/SSA抗体阴性的pSS患者和733例健康对照者。在pSS患者中,HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因阳性分别为159、246例;在健康对照者中,HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因阳性分别为196、282例;在抗SSA抗体阳性pSS患者中,HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因阳性分别为129、158例;在抗SSA抗体阴性pSS患者中,HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因阳性分别为30、46例。HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因多态性与pSS的易感性有关(I2分别为62.99%、40.75%,合计OR值分别为2.60、2.43,95%CI分别为1.49~4.55、1.88~3.14,P均<0.05)。HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因多态性也与抗Ro/SSA抗体阳性pSS的易感性有关(I2分别为0.00%、9.41%,合计OR值分别为3.85、2.61,95%CI分别为1.81~8.21、1.52~4.48,P均<0.05)。结论HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因多态性与抗Ro/SSA抗体阳性的pSS患者的易感性相关。具有HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因阳性的抗Ro/SSA抗体阳性患者更容易患pSS。

SSA/Ro60自身抗原的基因克隆与表达纯化

目的 克隆人SSA/Ro60自身抗原并表达纯化,为辅助诊断自身免疫提供物质基础。方法 采用RT-PCR技术扩增SSA/Ro60基因,定向插入pPICZ表达载体,转入毕赤酵母表达系统,将获得的重组蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果 扩增出约1.5kb的SSA/Ro60全长序列,获得相对分子质量60×103的重组蛋白,经鉴定具有SSA/Ro60抗原性。结论成功克隆并表达SSA/Ro60,为诊断自身免疫疾病奠定基础。

亲和层析法纯化系统性红斑狼疮特异性60KDRo/SSA抗原

目的:建立亲和层析法纯化Ro/SSA自身抗原系统中60KD组分的方法。方法:从猪脾提ENA(可提取核抗原),以硫酸铵沉淀、离子交换层析进行初步纯化。挑选单纯抗60KDSSA抗体阳性的病人的血清,制备亲和层析柱。用ELISA法检测所制备的抗原。结果: 60KDSSA抗体阳性标准血清ELISA检测为阳性,Sm和RNP、Jo-1、Scl-70的标准抗血清为阴性。结论:该方法可获得高纯度的抗原,可用于ELISA检测等目的。

系统性红斑狼疮特异性抗原60KD Ro/SSA的提取和纯化

目的建立从猪脾纯化Ro/SSA自身抗原系统中60KD组分的方法。方法从猪脾提取ENA(可提取核抗原),以硫酸铵沉淀结合离子交换层析分离ENA蛋白组分,并用对流免疫电泳检测60KDSSA抗原的活性,以得到纯化60KDSSA抗原的具体条件。结果60KDSSA抗原在Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中的硫酸铵沉淀范围是硫酸铵饱和度50%～60%。60KDSSA抗原在50mMTris-HCl缓冲液(pH8.3)+NaCl中的DE52离子交换层析洗脱范围为电导值35～40ms/cm。结论结合硫酸铵沉淀和DE52离子交换层析两种纯化方法所得的60KDSSA抗原相对于其它ENA有较高的纯度,并能有效分离中SSA中60KD、52KD两个组分。

人自身抗原SSA/Ro60的基因克隆和原核表达

目的:克隆并表达人自身抗原SSA/Ro60。方法:应用RT-PCR技术,从HL-60细胞株中克隆人自身抗原SSA/Ro60全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western blot。结果:PCR产物约为1.6 kb,与预期1614 bp接近,测序结果与Genebank报道的完全一致。pGEX-5T-SSA/Ro60重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白分子量为86 KD,具有天然人自身抗原SSA/Ro60的免疫原性。结论:成功克隆表达人自身抗原SSA/Ro60,为下一步工作奠定了基础。

自身抗原Ro/SSA抗原优势决定簇分析

目的： 探讨自身抗原Ｒｏ／ＳＳＡ（Ｍｒ＝ ６０ ０００）的抗原决定簇，为自身免疫性疾病机制的研究提供依据。方法： 根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析，采用ＰＣＲ法克隆自身抗原Ｒｏ／ＳＳＡ（Ｍｒ＝ ６０ ０００）多肽片段的ｃＤＮＡ，定向插入表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ，并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，用ＧＳＴ亲和层析柱进行纯化，经免疫印迹法与患者阳性血清进行反应。结果： Ｒｏ／ＳＳＡ（Ｍｒ＝ ６０ ０００）的抗原优势决定簇主要存在于１００～１９０位和１９１～３００位，不同患者、不同病程抗原优势决定簇有所不同。结论：抗原驱动机制在自身免疫性疾病的发病中起重要作用。

红斑狼疮皮损内角质形成细胞凋亡和SSA/Ro抗原的表达

目的 :探索光敏感红斑狼疮 (LE)皮损形成的机理和SSA/Ro抗原表达的来源。方法 :用原位切口标记法和免疫荧光法测定了 1 9例光敏感型红斑狼疮 (LE)患者新鲜皮损内自身抗原SSA/Ro表达情况和角质形成细胞凋亡情况。结果 :发现 7例LE皮损表皮内棘细胞周围有不同程度的颗粒状SSA/Ro抗原表达 ;而对照组无 1例荧光着色 ,1 3例皮损表皮棘细胞内可见凋亡细胞荧光着色。结论 :光敏感LE患者的角质形成细胞通过细胞凋亡释放SSA/Ro抗原 ,并参与皮损形成。

敲低Ro60/SSA表达对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响

目的:探讨下调Ro60/SSA的表达对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响。方法:将人肝癌细胞HAK-1A和HepG2分别分3组处理:空白对照组常规培养(DMEM培养基+体积分数10%胎牛血清);另两组脂质体法分别转染siRNA-NC和siRNA-Ro60/SSA,每组设置3个复孔。转染48 h后应用Western blot法检测细胞中Ro60/SSA蛋白的表达,应用克隆形成实验和球形形成实验检测细胞的自我更新和增殖能力;应用Transwell小室法检测3组HAK-1A细胞的迁移和侵袭能力。将雌性BALB/c裸鼠随机分为siRNA-NC组和siRNA-Ro60/SSA组,每组5只。将转染siRNA-NC或siRNA-Ro60/SSA的HAK-1A细胞以1×10^(4)个/μL尾静脉注射入裸鼠体内(200μL/只),4周后,计数肺部肿瘤灶数量。结果:与空白对照组和siRNA-NC组比较,siRNA-Ro60/SSA组HAK-1A和HepG2细胞Ro60/SSA蛋白表达下调,克隆形成数、成球率均降低(P<0.05)。siRNA-Ro60/SSA组HAK-1A细胞Transwell实验中的迁移细胞数和侵袭细胞数低于空白对照组和siRNA-NC组(P<0.05)。siRNA-Ro60/SSA组裸鼠肺部移植瘤数量低于siRNA-NC组(P<0.05)。结论:敲低Ro60/SSA可明显抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力。

核糖核蛋白SSA/Ro的结构及其特性

从组织细胞中提取的核糖核蛋白抗原SSA/Ro被广泛应用于临床中各种自身免疫性疾病检测 ,特别在检测SS、SLE、NLE等病人的血清中阳性率较高。因而在临床诊断上尚有十分重要的参考价值。本文综述了SSA/Ro抗原的结构、生物特性方面的研究情况 。

通过慢病毒载体构建SSA/Ro52稳定基因沉默细胞系

目的利用慢病毒载体持续表达RNA干扰序列抑制基因表达,建立SSA/Ro52稳定基因沉默细胞系,为进一步研究SSA/Ro52的功能提供有效工具。方法 4条SSA/Ro52特异序列(克隆1为TGGCATGGTCTCCTTCTACAA,克隆2为CTGCCTTCTTTATGGGACTTA,克隆9为TGAG从GTTGGAAGTGGAAAT,克隆1 1为AGTTATCCTATGGTCCTGGGT)和无关对照序列克隆至慢病毒载体pLKO-puro,表达后可形成小发卡结RNA(small hair-pin,shRNA),通过RNA干扰机制抑制特异基因表达。表达SSA/Ro52特异序列的克隆1、2、9、11以及表达无关序列的对照克隆(scramble,S)分别与包装载体pGag-Pol和pVSV-G共同转染293T细胞,收集含病毒颗粒的培养液。用表达SSA/Ro52特异序列和无关对照序列的病毒颗粒感染Hela细胞,抗生素筛选,建立稳定细胞系。以GAPDH为内对照定量实时PCR检测SSA/Ro52 mRNA的表达。免疫印记检测SSA/Ro52蛋白,扫描SSA/Ro52条带与β-actin条带相比为SSA/Ro52蛋白的相对表达水平。克隆1、2、9、11转染细胞中SSA/Ro52的表达水平与对照克隆S的比值为基因表达的抑制程度。结果慢病毒颗粒可以有效感染Hela细胞,含shRNA表达框架的病毒序列可以整合至细胞基因组,形成稳定细胞系。克隆1、2、9、1 1转染细胞在抗生素筛选3 d后,其SSA/Ro52 mRNA表达水平分别是克隆S转染细胞的25.5%、31.2%、13.0%和77.2%;而上述克隆转染细胞SSA/Ro52蛋白表达水平是对照的5%、50%、10%和80%。培养4周后上述克隆SSA/Ro52蛋白表达水平没有明显变化。但用干扰素α刺激细胞后,SSA/Ro52在对照克隆转染细胞中表达增加,而克隆1、2、9、11转染细胞SSA/Ro52的表达是对照的30%、70%、5%和100%。结论克隆1、2、9可以有效抑制SSA/Ro52的表达,通过慢病毒载体转染细胞建立了SSA/Ro52稳定基因静默细胞系。在SSA/Ro52表达被上调时,克隆9仍然可以有效抑制SSA/Ro52的表达,为进一步研究SSA/Ro52的功能打下了基础。

亲和层析法纯化系统性红斑狼疮特异性60KD Ro／SSA抗原

目的建立亲和层析法纯化Ro／SSA自身抗原系统中60KD组分的方法。方法从猪脾提ENA(可提取核抗原)，以硫酸铵沉淀、离子交换层析进行初步纯化。挑选单纯抗60KD SSA抗体阳性的病人的血清，制备亲和层析柱。用ELISA法检测所制备的抗原。结果60KD SSA抗体阳性标准血清ELISA检测为阳性，Sm和RNP、Jo-1、Scl-70的标准抗血清为阴性。结论该方法能获得高纯度的抗原，可用于ELISA检测等目的。

52000Ro/SSA抗原结构分析及抗原片段克隆

目的预测相对分子量为52000的Ro/SSA自身抗原的可能表位,并选择性克隆含亮氨酸拉链氨基酸序列的抗原片段。方法用蛋白结构分析软件对52000Ro/SSA抗原结构进行分析,从人心脏来源的cDNA中通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到编码第119至264位氨基酸片段的cDNA,插入表达载体,转染大肠杆菌并表达融合蛋白。结果计算机分析显示该抗原中有α螺旋结构,整个分子抗原性强,柔韧性一般,表面可及性差。PCR产物长440bp,重组融合蛋白相对分子质量为28000,测序鉴定保证了研究的正确性。结论52000Ro/SSA多肽抗原性好,所获得的抗原片段为今后研究亮氨酸拉链氨基酸序列在该抗原表位形成中的作用奠定了基础。

60 kD人SSA抗原表位免疫反应的特异性

目的：根据６０ｋＤＳＳＡ抗原分子不同表位的氨基酸序列，人工合成多倍体寡肽抗原表位（ｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＭＡＰｓ），以检测这些表位的免疫特性。方法：用ＭＡＰｓ做亲和层析柱，用抗ＳＳＡ抗体的病人血清过柱，纯化抗ＭＡＰｓ抗体。这些纯化后的抗ＭＡＰｓ抗体可与６０ｋＤＳＳＡ抗原及ＭＡＰｓ反应。这种反应能被６０ｋＤＳＳＡ抗原及相对应的ＭＡＰｓ抑制。以ＭＡＰｓ做抗原检测６７份具有抗ＳＳＡ抗体的血清。结果：６７份病人血清中，６３份阳性，阳性率９４％，这些血清结合的ＭＡＰｓ不同，可以从１至２０个ＭＡＰｓ不等。结论：研究表明，６０ｋＤＳＳＡＭＡＰｓ保留了６０ｋＤＳＳＡ抗原的抗原性。

线性免疫印迹法检测抗60 kD Ro/SSA IgG抗体的对比分析

目的评价5个不同厂家自身抗体谱线性免疫印迹法(LIA)试剂中的抗60 k D Ro/SSA Ig G抗体项目的一致性及符合率。方法收集本院54例自身免疫性疾病病人和10份2013年卫生部临检中心室间质评血清及30例健康人血清,同时使用酶联免疫吸附(ELISA)法和5个不同品牌LIA法试剂对血清中的抗60 k D Ro/SSA Ig G抗体进行检测,比较5个不同品牌LIA法试剂检测60 k D Ro/SSA Ig G抗体的一致性及总体符合率。结果 ELISA法试剂盒检测94例血清中阳性标本37例,阴性标本57例,同时进行的5种不同品牌LIA法抗核抗体谱试剂检测抗60 k D Ro/SSA Ig G抗体结果的总体符合率均超过90%,吻合系数均>0.8,说明一致性很好,但5种品牌均出现不相一致的阳性和阴性。结论 LIA法的抗核抗体谱检测试剂盒在检测抗60 k D Ro/SSA Ig G抗体项目中一致性很好,但检测结果可疑时应使用天然抗原包被的ELISA法试剂或双向扩散法进行复测。

自身抗原Ro60kD重组融合蛋白的纯化和鉴定

将表达Ro60kDGST融合蛋白的重组体导入大肠杆菌JM109 中表达重组抗原, 经GST亲和层析柱纯化后用标准抗Ro血清鉴定, 经免疫印迹法证实, 纯化重组蛋白具有Ro 抗原性,

发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白特异结合宿主细胞60kD SSA/Ro

为了初步探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核蛋白(nucleoprotein,NP)对宿主细胞免疫功能的影响。将SFTSV NP和NSs蛋白的编码基因插入真核表达载体VR1012中,通过免疫共沉淀(IP)、SDS-PAGE、质谱检测及蛋白质免疫印迹等方法寻找宿主细胞中与NP相互作用,同时又与免疫功能有关的蛋白质分子,并利用细胞免疫荧光方法检测SFTSV NP与该分子在细胞中的共定位情况。IP和质谱检测结果显示NP能与免疫功能相关的60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,细胞免疫荧光试验进一步显示NP与60kD SSA/Ro蛋白在细胞质中存在共定位。提示SFTSV可能通过其核蛋白与免疫相关分子60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,从而引起机体一系列的免疫反应和临床症状。