人自身抗原SSA52的酵母重组分泌表达及其斑点免疫金渗滤法的建立

人自身抗原SSA52通常采用组织提取法或原核表达获得,存在诸多问题。通过基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人自身抗原SSA52,并建立斑点免疫金渗滤法。采用RT-PCR扩增SSA52基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SSA52。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定,并建立斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtration assay,DIGFA),进行初步临床应用对比研究。结果显示,RT-PCR产物约为1 400 bp,与预期1 428 bp接近,pPIC9k-SSA52重组阳性克隆测序结果与基因库核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物SSA52的相对分子质量约52 kD。Western blot法证实表达产物具有天然SSA52分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。DIGFA与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为95.2%(120/126),阴性符合率为94.0%(47/50),总符合率为94.9%(167/176);两种方法检测结果无统计学显著差异(P>0.05)。说明SSA52在毕赤酵母中分泌表达成功,建立的DIGFA简便、快速、准确。

抗SSA60、SSA52、SSB/La抗体及抗着丝点B抗体在老年性干燥综合征干眼症诊断中的意义

目的探讨抗SSA60、SSA52、SSB/La抗体及抗着丝点B抗体在老年性干燥综合征干眼症诊断中的意义。方法选取2015年7月至2019年11月在我院风湿免疫科和眼科就诊的老年性干燥综合症患者157例,在确诊为干眼的患者中采用免疫印迹法和双扩散法检测抗SSA60、SSA52、SSB/La抗体及抗着丝点B抗体的表达情况。比较泪液分泌时间、泪膜破裂时间、角膜荧光素染色评分和干眼评分四个指标,分析其意义。结果老年性干燥综合症患者中,有79例为干眼症,阳性率为50.3%。其中抗SSA60抗体、抗SSA52抗体、抗SSB/La抗体,抗着丝点B抗体阳性比例分别为52.2%,占52.2%,占33.1%,占11.4%。抗SSA60抗体、抗SSA52抗体、抗SSB/La抗体阳性和阴性患者在老年性干燥综合征患者干眼症中比较都有统计学意义(P<0.01),抗着丝点B抗体阳性和阴性患者在老年性干燥综合征患者的干眼症中比较有统计学意义(P<0.05)。抗SSA60抗体阳性、抗SSA52抗体阳性的患者相对于阴性患者来说,出现泪液分泌时间和泪膜破裂时间短、角膜荧光素染色评分和干眼评分高,两组患者差异均有统计学意义(P<0.001)。抗SSB/La抗体阳性的患者相对于阴性患者来说,出现泪液分泌时间和泪膜破裂时间短、角膜荧光素染色评分和干眼评分高,两组患者差异均有统计学意义(P<0.01)。抗着丝点B抗体阳性的患者相对于阴性患者来说,出现泪液分泌时间短,两组患者差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者泪膜破裂时间、角膜荧光素染色评分、干眼评分差异无统计学意义(P>0.05)。结论抗SSA60、SSA52、SSB/La抗体及抗着丝点B在老年性干燥综合征中干眼症患者中被检测比例高,4种抗体的联合检测能提示干眼症的发生,其中抗SSA60抗体、抗SSA52抗体、抗SSB/La抗体可能意义更大。

自身抗原SSA/Ro-52kD抗原优势表位分析

探讨自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ的抗原优势表位，为疾病机制的研究提供依据，根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析。采用ＰＣＲ法克隆自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ多肽片段的ｃＤＮＡ，定向插入表达载体ＰＧＥＸ－５Ｘ－１，并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，用ＧＳＴ亲和层析柱进行纯化，经免疫印迹法与病人阳性血清进行反应，结果表明片段Ｒｏ５２３具有较强的抗原性。

自身抗原52 kD-Ro/SSA的序列分析及抗原性预测

目的：分析自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的序列结构，预测其抗原位点。方法：将自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的氨基酸序列输入“蛋白质结构预测”软件包，分析蛋白质分子亲水性、表面可及性、柔性，并模拟其二级结构，预测其主要抗原位点。结果：自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ是多抗原位点，其氨基酸序列中１２０～１３０、３００～３２０、３６０～３８０位间抗原性较强。结论：确定５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的抗原优势表位，为研究抗原抗体间相互作用及其疾病机制打下基础。

利用重组抗原检测抗SSA/Ro-52kD自身抗体及其临床意义

目的重组表达 SSA/ Ro- 5 2 k D融合蛋白 ,并用于检测自身抗体。方法应用 DNA重组技术构建 SSA/Ro- 5 2 k D工程菌 ,并表达 SSA/ Ro- 5 2 k D融合蛋白。经谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)柱层析纯化后 ,作为抗原 ,分别用免疫印迹法 (IBT)和酶联免疫吸附试验 (EL ISA)检测 2 0份 SS患者血清、6 0份 SL E患者血清和 30份正常人血清。结果重组抗原检测抗 SSA/ Ro- 5 2 k D自身抗体敏感性较高 ,而且抗体滴度与病程相关。结论利用重组抗原对自身抗体进行定性。

通过慢病毒载体构建SSA/Ro52稳定基因沉默细胞系

目的利用慢病毒载体持续表达RNA干扰序列抑制基因表达,建立SSA/Ro52稳定基因沉默细胞系,为进一步研究SSA/Ro52的功能提供有效工具。方法 4条SSA/Ro52特异序列(克隆1为TGGCATGGTCTCCTTCTACAA,克隆2为CTGCCTTCTTTATGGGACTTA,克隆9为TGAG从GTTGGAAGTGGAAAT,克隆1 1为AGTTATCCTATGGTCCTGGGT)和无关对照序列克隆至慢病毒载体pLKO-puro,表达后可形成小发卡结RNA(small hair-pin,shRNA),通过RNA干扰机制抑制特异基因表达。表达SSA/Ro52特异序列的克隆1、2、9、11以及表达无关序列的对照克隆(scramble,S)分别与包装载体pGag-Pol和pVSV-G共同转染293T细胞,收集含病毒颗粒的培养液。用表达SSA/Ro52特异序列和无关对照序列的病毒颗粒感染Hela细胞,抗生素筛选,建立稳定细胞系。以GAPDH为内对照定量实时PCR检测SSA/Ro52 mRNA的表达。免疫印记检测SSA/Ro52蛋白,扫描SSA/Ro52条带与β-actin条带相比为SSA/Ro52蛋白的相对表达水平。克隆1、2、9、11转染细胞中SSA/Ro52的表达水平与对照克隆S的比值为基因表达的抑制程度。结果慢病毒颗粒可以有效感染Hela细胞,含shRNA表达框架的病毒序列可以整合至细胞基因组,形成稳定细胞系。克隆1、2、9、1 1转染细胞在抗生素筛选3 d后,其SSA/Ro52 mRNA表达水平分别是克隆S转染细胞的25.5%、31.2%、13.0%和77.2%;而上述克隆转染细胞SSA/Ro52蛋白表达水平是对照的5%、50%、10%和80%。培养4周后上述克隆SSA/Ro52蛋白表达水平没有明显变化。但用干扰素α刺激细胞后,SSA/Ro52在对照克隆转染细胞中表达增加,而克隆1、2、9、11转染细胞SSA/Ro52的表达是对照的30%、70%、5%和100%。结论克隆1、2、9可以有效抑制SSA/Ro52的表达,通过慢病毒载体转染细胞建立了SSA/Ro52稳定基因静默细胞系。在SSA/Ro52表达被上调时,克隆9仍然可以有效抑制SSA/Ro52的表达,为进一步研究SSA/Ro52的功能打下了基础。

抗SSA/Ro52抗体阳性获得性血友病A1例报告并文献复习

获得性血友病A(AHA)是较少见的血液系统疾病,主要表现为黏膜、肌肉、内脏的出血,并且出血通常具有自发性、突然性、弥漫性和危急性,诊治不及时可造成严重出血,导致患者死亡。本文通过报道1例抗SSA/Ro52阳性AHA患者的临床诊断及治疗过程,旨在加深对于AHA的认识。

HCV感染者抗SSA/Ro52抗体及其IgG亚型检测的意义

目的分析检测HCV感染者抗SSA/Ro52抗体及其Ig G亚型的意义。方法选取2012年1月至2014年8月开封市中心医院收治的临床确诊HCV感染者60例,同期系统性红斑狼疮(SLE)患者56例,干燥综合征患者23例,健康体检者60例,用线性免疫印迹法筛查抗SSA/Ro52抗体,间接ELISA检测抗SSA/Ro52抗体Ig G亚型。结果 HCV感染者抗SSA/Ro52抗体阳性率较SLE以及干燥综合征患者低(P<0.05),HCV感染者的单项阳性率高于SLE以及干燥综合征患者(P<0.05)。HCV感染者、SLE、干燥综合征阳性患者Ig G1亚型阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论单项抗SSA/Ro52抗体阳性是区分HCV感染是否合并干燥综合征的重要指标之一。

结缔组织病血液系统损害与自身抗体及免疫学指标的相关性分析

目的探讨结缔组织病(CTD)患者血液系统损害与自身抗体及免疫学指标的相关性。方法回顾性分析137例CTD患者血液系统损害情况,同时对伴与不伴血液系统损害的CTD患者自身抗体及免疫学指标检测结果进行对比分析。结果 CTD患者出现血液系统损害的阳性率,分别为系统性红斑狼疮(SLE)75%、原发性干燥综合征(p SS)54%、类风湿关节炎(RA)39%、未分化结缔组织病(UCTD)63%。SLE三系损害发生率最高(50%),与p SS、RA、UCTD三系损害发生率比较差异有统计学意义。p SS与RA均以单系损害为主,比例分别为58%、85%;p SS以白细胞、血小板下降为主,RA以血红蛋白下降为主。UCTD单系与多系损害比例无明显差异。伴与不伴血液系统损害的CTD患者一般情况及免疫学指标之间比较差异无统计学意义;自身抗体之间比较显示,抗SSA/Ro60抗体、抗SSA/Ro52抗体阳性差异有统计学意义。结论 CTD患者发生血液系统损害概率高,其中以SLE发生率最高,SLE三系损害最常见。自身抗体中抗SSA/Ro60抗体、抗SSA/Ro52抗体与结缔组织病血液系统损害具有相关性。

抗MDA5抗体和抗SSA/Ro52抗体双阳性皮肌炎的临床分析(附5例报告及文献复习)

目的探讨抗MDA5抗体和抗SSA/Ro52抗体双阳性皮肌炎的临床特征及治疗。方法回顾性分析5例抗MDA5抗体和抗SSA/Ro52抗体双阳性皮肌炎患者的临床资料,结合文献复习进行讨论。结果5例患者中男性1例、女性4例。主要临床表现为典型皮疹及肢体无力,可伴有呼吸困难、关节症状及口干眼干等症状,均诊断为抗MDA5抗体和抗SSA/Ro52抗体双阳性皮肌炎,且合并间质性肺炎;患者平均发病年龄(62.2±6.18)岁,平均病程(4.2±1.64)个月;1例患者血清肌酸激酶升高(472 U·L^-1);诊断明确后5例患者均接受了糖皮质激素与免疫抑制剂联合治疗。结论抗MDA5抗体与抗SSA/Ro52抗体双阳性的皮肌炎临床主要表现为典型皮疹,肢体无力、呼吸困难、关节症状及口干眼干等症状常见,血清肌酸激酶升高不明显,易合并间质性肺病;糖皮质激素与免疫抑制剂联合治疗为主要方案。预后不良。